En sammenligning av forskjellige teknikker for superoppløsningsmikroskopi
For konvensjonell lysmikroskopi begrenser diffraksjon av lys bildeoppløsningen til omtrent 250 nm. I dag kan superoppløsningsteknikker forbedre dette med mer enn en faktor 10. Denne teknikken oppnås hovedsakelig gjennom tre metoder: enkeltmolekyllokaliseringsmikroskopi, inkludert fotosensitiv lokaliseringsmikroskopi (PALM) og stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM); strukturert belysningsmikroskopi (SIM); og stimulert emisjonsdeplesjonsmikroskopi (STED). Hvordan velge superoppløsningsteknologi er det alle bryr seg om. "Dessverre er det ingen enkle prinsipper for å bestemme hvilken metode som skal brukes," sier Mathew Stracy, en postdoktor ved University of Oxford, Storbritannia. "Hver har sine egne fordeler og ulemper." Forskere finner selvfølgelig også ut hvordan de skal velge riktig metode for et bestemt prosjekt. "I sammenheng med bioimaging inkluderer nøkkelfaktorer å vurdere: romlig og tidsmessig oppløsning, følsomhet for fotoskader, merkekapasitet, prøvetykkelse og bakgrunnsfluorescens eller celleautolog fluorescens." Slik fungerer det De forskjellige superoppløsningsmikroskopene fungerer på forskjellige måter. Når det gjelder PALM og STORM, er bare en liten del av fluorescerende markører eksitert eller fotoaktivert på et gitt øyeblikk, noe som muliggjør deres uavhengige lokalisering med høy presisjon. Å gå gjennom denne prosessen med alle de fluorescerende etikettene resulterer i et fullstendig superoppløsningsbilde. Stefan Hell, en av vinnerne av Nobelprisen i kjemi 2014 og direktør for Max Planck Institute of Biophysical Chemistry, sa: "PALM/STORM-systemet er relativt enkelt å sette opp, men det er vanskelig å bruke, fordi det fluorescerende gruppen må ha fotoaktiveringsevne. Begrensninger Ulempen er at de trenger å oppdage et enkelt fluorescerende molekyl i sammenheng med en celle, og er mindre pålitelige enn STED." STED bruker en laserpuls for å eksitere fluoroforen og en ringformet laser for å slukke fluoroforen, og etterlater bare den mellomliggende nanometerstore fluorescensen for superoppløsning. Skanning av hele prøven produserer et bilde. "Fordelen med STED er at det er en trykknappteknologi," forklarte Hell. "Det fungerer som et standard konfokalt fluorescensmikroskop." Det kan også avbilde levende celler ved hjelp av fluoroforer som grønne eller gule fluorescerende proteiner og rhodamin-avledede fargestoffer. Parametrisk sammenligning Selv om alle superoppløsningsteknikker overgår konvensjonell lysmikroskopi når det gjelder oppløsning, skiller de seg fra hverandre. SIM dobler omtrent oppløsningen til rundt 100 nm. PALM og STORM kan løse 15 nm mål. I følge Hell gir STED en romlig oppløsning på 30 nm i levende celler og 15 nm i faste celler. Når det gjelder spesifikke applikasjoner, må vi også vurdere signal-til-støy-forholdet. I noen tilfeller kan lavere oppløsning men høyere SNR resultere i et bedre bilde enn det motsatte (høyere oppløsning men lavere SNR). Hastigheten på bildeopptak er også veldig viktig, spesielt for levende celler. "Alle superoppløsningsteknikker er tregere enn konvensjonelle fluorescensavbildningsteknikker," sa Stracy. "PALM/STORM er den tregeste, den trenger titusenvis av bilder for å få et enkelt bilde, SIM trenger dusinvis av bilder, og STED er en skanneteknologi, så innhentingshastigheten avhenger av størrelsen på synsfeltet." I tillegg til levende celler eller faste bildeceller, ønsker noen forskere også å forstå hvordan objekter beveger seg. Stracy er interessert i å forstå dynamikken til biologiske systemer i levende celler, ikke bare statiske bilder. Han kombinerer PALM med enkeltpartikkelsporing for å analysere dynamikk i levende celler. På denne måten kan han direkte spore markørmolekylene når de utfører sine funksjoner. Han mener imidlertid at SIM ikke er egnet til å studere disse dynamiske prosessene på molekylært nivå, men på grunn av sin raske oppsamlingshastighet er den spesielt egnet til å observere dynamikken til større strukturer, som hele kromosomer. De siste resultatene I 2017 rapporterte Hells team MINFLUX superoppløsningsmikroskop i Science. I følge Hell oppnår denne superoppløsningsmetoden en romlig oppløsning på 1 nm for første gang. I tillegg kan den spore individuelle molekyler i levende celler minst 100 ganger raskere enn andre metoder. Andre forskere snakket også høyt om MINFLUX-mikroskopet. "Nye applikasjoner og tilnærminger utvikles stadig, men to fremskritt skiller seg ut for meg," sa Shechtman. Den ene er MINFLUX. "Den bruker en genial tilnærming for å få svært presis molekylær posisjonering." Når det gjelder den andre spennende utviklingen, nevnte Shechtman WE Moerner og hans kolleger ved Stanford University. Moerner var også mottaker av Nobelprisen i kjemi i 2014. En av vinnerne. For å adressere begrensningen av bildeoppløsning forårsaket av anisotropisk spredning av fluorescerende enkeltmolekyler, brukte forskerne forskjellige eksitasjonspolarisasjoner for å bestemme orienteringen og posisjonen til molekylene. I tillegg har de utviklet delikate pupilloverflater. Disse teknikkene forbedrer evnen til å lokalisere strukturer. Om fluorescerende etiketter I mange applikasjoner med superoppløsning betyr etiketter virkelig. Det er også noen selskaper som leverer relaterte produkter. For eksempel har tyske Miltenyi slått seg sammen med Abberior, et selskap grunnlagt av Stefan Hell, for å tilby tilpassede antistoffkonjugeringstjenester for superoppløsningsmikroskopifargestoffer. En rekke andre selskaper tilbyr også matchende markører. "Våre Nano-Boostere er veldig små, bare 1,5 kDa, og svært spesifikke," sier Christoph Eckert, markedsansvarlig i ChromoTek. Disse proteinene binder grønne og røde fluorescerende proteiner (GFP og RFP). De er avledet fra alpakka-antistofffragmenter, kjent som VHH eller nanobodies, med utmerkede bindingsegenskaper og stabil kvalitet uten batch-til-batch-variasjon. Disse markørene passer for ulike superoppløsningsteknikker, inkludert SIM, PALM, STORM og STED. Ai-Hui Tang, en assisterende professor ved University of Maryland School of Medicine, og kolleger brukte ChromoTeks GFP-Booster og STORM for å utforske informasjonsforplantning i nervesystemet. De fant molekylære nanokluster, kalt nanokolonner, i presynaptiske og postsynaptiske nevroner. Forskerne mener at denne strukturen viser at sentralnervesystemet bruker enkle prinsipper for å opprettholde og regulere synaptisk effektivitet. Ulike versjoner av superoppløsningsbilder og et økende antall metoder tar forskerne enda dypere inn i biologiske mysterier. Ved å bryte diffraksjonsgrensen for synlig lys, kan biologer til og med "overvåke" cellenes handlinger.
