Sammenligning mellom konfokalmikroskop og vanlig optisk mikroskop
Generelt optisk mikroskop
Det generelle biologiske mikroskopet består av tre deler, nemlig: ① belysningssystem, inkludert lyskilde og kondensator; ② Optisk forsterkningssystem, som består av objektivlinse og okular, er hoveddelen av mikroskopet. For å eliminere sfærisk aberrasjon og kromatisk aberrasjon, er både okularet og objektivet sammensatt av komplekse linsegrupper; (3) mekanisk enhet, brukt til å feste materialer og praktisk observasjon.
Hvorvidt mikroskopbildet er klart eller ikke, avhenger ikke bare av forstørrelsen, men også av oppløsningen til mikroskopet. Oppløsning refererer til evnen til mikroskopet (eller stedet der menneskelige øyne er 25 cm unna målet) til å skille mellom det lille intervallet til objektet zui. Oppløsningen avhenger av lysets bølgelengde, blenderforholdet og brytningsindeksen til mediet, som uttrykkes med formelen:
R=0.61λ /N．A. N．A．＝ｎsin /2
Hvor: n= brytningsindeks for medium;=speilvinkel (åpningsvinkelen til prøven til linseåpningen), og NA= numerisk blenderåpning. Speilvinkelen er alltid mindre enn 180? Derfor må zui-verdien til sina/2 være mindre enn 1.
Brytningsindeksen til glasset som brukes til å lage optiske linser er 1,65 ~ 1,78, og brytningsindeksen til mediet som brukes er nærmere glasset, jo bedre. For den tørre objektivlinsen er mediet luft, og blenderforholdet er vanligvis 0.05 ~ 0,95; Oljelinsen bruker velduftende asfalt som medium, og linsens åpningshastighet kan være nær 1,5.
Bølgelengden til vanlig lys er 400~700nm, så oppløsningen til mikroskopet er ikke mindre enn 0,2μm, og oppløsningen til det menneskelige øyet er 0,2mm, så den store forstørrelsen til zui designet av generelt mikroskop er vanligvis 1000X x.
Hvorfor trenger du et konfokalt mikroskop?
1. Det optiske mikroskopet har blitt perfeksjonert gjennom innsatsen og forbedringen av våre store forgjengere. Faktisk kan vanlige mikroskoper gi oss vakre mikroskopiske bilder enkelt og raskt. Imidlertid skjedde en hendelse som brakte revolusjonerende innovasjon til denne nesten perfekte mikroskopverdenen, som er oppfinnelsen av "laserskanning konfokalmikroskop". Dette nye mikroskopet kjennetegnes ved å ta i bruk et optisk system som bare trekker ut bildeinformasjonen på planet der fokuset er konsentrert, og gjenopprette den innhentede informasjonen i bildeminnet samtidig som man endrer fokus, slik at et levende bilde med fullstendig tredimensjonal informasjon kan fås. Ved denne metoden kan informasjon om overflateformen som ikke kan bekreftes med vanlige mikroskoper enkelt fås. I tillegg, for vanlige optiske mikroskoper, er "forbedring av oppløsningen" og "utdyping av fokusdybden" motstridende forhold, spesielt ved høy forstørrelse, men for konfokale mikroskoper er dette problemet løst.
2. Fordeler med konfokalt optisk system
Konfokalt optisk system belyser prøvepunktet, og det reflekterte lyset mottas også av punktreseptorer. Når prøven er plassert i fokusposisjonen kan nesten alt det reflekterte lyset nå fotoreseptoren, men når prøven avviker fra fokuset kan ikke det reflekterte lyset nå fotoreseptoren. Det vil si at i det konfokale optiske systemet vil bare bildet som faller sammen med fokuset bli sendt ut, og facula og ubrukelig spredt lys vil bli skjermet.
3. Hvorfor bruke laser?
I det konfokale optiske systemet belyses prøven og det reflekterte lyset mottas også av en punktfotoreseptor. Derfor blir punktlyskilde nødvendig. Laser tilhører en veldig punktlyskilde. I de fleste tilfeller bruker lyskilden til konfokalmikroskop laserlyskilde. I tillegg er egenskapene til laser, som monokromatisitet, retningsevne og utmerket stråleform, også viktige årsaker til den brede bruken.
4. Sanntidsobservasjon basert på høyhastighetsskanning blir mulig.
I laserskanningen brukes den akustiske optiske deflektoren (AO prime element) i horisontal retning og Servo Galvano-speilet brukes i vertikal retning. Fordi det ikke er noen mekanisk vibrasjonsdel i den akustiske optiske avbøyningsenheten, kan den skanne med høy hastighet, og det er mulig å observere i sanntid på overvåkingsskjermen. Den høye hastigheten til dette kameraet er et veldig viktig prosjekt som direkte påvirker hastigheten på fokusering og posisjonshenting.
5. Sammenheng mellom fokusposisjon og lysstyrke
I det konfokale optiske systemet, når prøven er riktig plassert i fokusposisjonen, er lysstyrken stor, og før og etter den vil lysstyrken synke kraftig (heltrukken linje i figur 4). Denne sensitive selektiviteten til fokalplanet er også prinsippet for å måle høyderetningen til konfokalmikroskopet og utvide brenndybden. Derimot har det vanlige optiske mikroskopet ikke tydelig lysstyrkeendring før og etter fokusposisjonen (stiplet linje i figur 4).
6. Høy kontrast og høy oppløsning
I et generelt optisk mikroskop vil det reflekterte lyset som avviker fra fokus forstyrre, og det vil overlappe med fokusavbildningsdelen, og dermed redusere bildekontrasten. I kontrast, i det konfokale optiske systemet, fjernes det spredte lyset utenfor fokuset og det spredte lyset inne i objektivlinsen nesten fullstendig, slik at et bilde med svært høy kontrast kan oppnås. I tillegg, fordi lyset passerer gjennom objektivlinsen to ganger, skjerpes punktbildet først, og oppløsningen til mikroskopet forbedres også.
7. Optisk lokaliseringsfunksjon
I det konfokale optiske systemet er det reflekterte lyset til delen som ikke er brennpunktet skjermet av mikroporer. Derfor, når du observerer en tredimensjonal prøve, dannes et bilde som det som er dannet etter å ha skjært prøven med fokus (Figur 5). Denne effekten kalles optisk lokalisering, som tilhører en av spesialitetene til konfokalt optisk system.
8. Fokuser bevegelig minnefunksjon
Det såkalte reflekterte lyset utenfor fokuset er skjermet av mikroporene. På den annen side kan det betraktes at alle punkter på bildet dannet av det konfokale optiske systemet faller sammen med fokuset. Derfor, hvis den tredimensjonale prøven flyttes langs Z-aksen (optisk akse) retning, vil bildet bli akkumulert og lagret i minnet, og zui vil til slutt få bildet dannet av sammenfallet av hele prøven og fokuset . På denne måten kalles funksjonen til uendelig fokusdybde mobilminnefunksjon.
9. Overflateformmålingsfunksjon
I funksjonen for fokusbevegelse kan overflateformen til prøven måles på en ikke-kontakt måte ved å legge til en høyderegistreringsløkke. Basert på denne funksjonen er det mulig å registrere Z-aksekoordinatene dannet av den store lysstyrkeverdien til zui i hver piksel, og basert på denne informasjonen kan informasjonen knyttet til overflateformen til prøven fås.
10. Høypresisjon mikrostørrelse målefunksjon
Lysmottaksenheten tar i bruk en endimensjonal CCD-avbildningssensor, slik at den kan være upåvirket av skanningshellingen til skanneenheten, slik at måling med høy presisjon kan fullføres. I tillegg, fordi funksjonen for fokusbevegelsesminne med justerbar fokusdybde tas i bruk samtidig, kan målefeilen forårsaket av fokusforskyvning elimineres.
11. Tredimensjonal bildeanalyse
Ved å bruke funksjonen for måling av overflateform kan det tredimensjonale bildet av prøveoverflaten enkelt lages. Ikke bare det, men også mange typer analyser kan utføres, for eksempel: overflateruhetsmåling, areal, volum, overflateareal, sirkularitet, radius, lengde på zui, omkrets, tyngdepunkt, tomografisk bilde, FFT-transformasjon, linje breddemåling og så videre.
Laser konfokalt skanningsmikroskop kan brukes ikke bare til å observere cellemorfologi, men også for kvantitativ analyse av biokjemiske komponenter i celler, optisk tetthetsstatistikk og cellemorfologimåling.
