Forskjellen mellom fluorescensmikroskop og normalt mikroskop
1. Se på belysningsmetoden
Belysningsmetoden til fluorescensmikroskop er generelt epi-type, det vil si at lyskilden plasseres på testprøven gjennom objektivlinsen.
2. Se på oppløsningen
Fluorescensmikroskoper bruker ultrafiolett lys som lyskilde, med relativt kort bølgelengde, men oppløsningen er høyere enn for vanlige optiske mikroskoper.
3, forskjellen i filteret
Fluorescensmikroskop bruker to spesielle filtre, som brukes foran lyskilden for å filtrere ut synlig lys, og brukes mellom objektivlinsen og okularet for å filtrere ut ultrafiolett lys, som kan beskytte menneskelige øyne.
Fluorescensmikroskop er også en type optisk mikroskop, hovedsakelig fordi bølgelengden eksitert av fluorescensmikroskopet er kort, så dette fører til forskjellen i strukturen og bruken av fluorescensmikroskopet og det vanlige mikroskopet. De fleste av fluorescensmikroskopene har en god funksjon for å fange opp svakt lys. , så under ekstremt svak fluorescens er dens avbildningsevne også god. Sammen med den kontinuerlige forbedringen av fluorescensmikroskopi de siste årene, har støy også blitt kraftig redusert. Derfor brukes flere og flere fluorescensmikroskoper.
Kunnskap om to-foton fluorescensmikroskopi
Grunnprinsippet for to-foton-eksitasjon er: ved høy fotontetthet kan fluorescerende molekyler absorbere to langbølgelengdefotoner samtidig, og etter en veldig kort såkalt eksitert tilstandslevetid sende ut et kortbølgelengdefoton ; effekten er den samme som å bruke et foton med en bølgelengde som er halvparten av den lange bølgelengden for å eksitere et fluorescerende molekyl. To-foton-eksitasjon krever høy fotontetthet, og for ikke å skade celler bruker to-fotonmikroskopi høyenergi-moduslåste pulslasere. Denne laseren sender ut laserlys med høy toppenergi og lav gjennomsnittsenergi, med en pulsbredde på kun 100 femtosekunder og en frekvens på 80 til 100 MHz. Når en objektivlinse med høy numerisk blenderåpning brukes til å fokusere fotonene til den pulserende laseren, er fotontettheten ved fokuspunktet til objektivlinsen høyest, og to-foton-eksitasjonen skjer bare ved fokuspunktet til objektivlinsen, så to-foton-mikroskopet trenger ikke et konfokalt nålehull, noe som forbedrer effektiviteten for fluorescensdeteksjon.
I det generelle fluorescensfenomenet, på grunn av den lave fotontettheten til eksitasjonslyset, kan et fluorescerende molekyl bare absorbere ett foton samtidig, og deretter sende ut et fluorescerende foton gjennom strålingsovergangen, som kalles enkeltfotonfluorescens. For fluorescenseksitasjonsprosessen med laser som lyskilde, kan to-foton eller til og med multi-foton fluorescensfenomen forekomme. På dette tidspunktet er intensiteten til eksitasjonslyskilden som brukes høy, og fotontettheten oppfyller kravet om at det fluorescerende molekylet absorberer to fotoner samtidig. I prosessen med å bruke en generell laser som eksitasjonslyskilde, er fotontettheten fortsatt ikke nok til å produsere to-fotonabsorpsjon. Vanligvis brukes en femtosekund pulserende laser, og dens øyeblikkelige kraft kan nå størrelsesorden megawatt. Derfor er bølgelengden til to-foton-fluorescensen kortere enn bølgelengden til eksitasjonslyset, som tilsvarer effekten produsert av halveksitasjonsbølgelengdeeksitasjonen.
To-foton fluorescensmikroskopi har mange fordeler:
1) Lys med lang bølgelengde påvirkes mindre av spredning enn lys med kort bølgelengde og kan lett trenge gjennom prøven;
2) De fluorescerende molekylene utenfor fokalplanet er ikke eksitert, slik at mer eksitasjonslys kan nå fokalplanet, slik at eksitasjonslyset kan trenge dypere prøver;
3) Nær-infrarødt lys med lang bølgelengde er mindre giftig for celler enn lys med kort bølgelengde;
4) Når du ser på prøver med to-fotonmikroskopi, er fotobleking og fototoksisitet kun tilstede i fokalplanet. Derfor er tofotonmikroskopi mer egnet for å se tykke prøver enn enkeltfotonmikroskopi, for å se levende celler eller for å utføre fotoblekeeksperimenter med fast punkt.
Kunnskap om konfokal fluorescensmikroskopi
Grunnprinsippet for konfokal fluorescensmikroskopi: ved å bruke en punktlyskilde for å belyse prøven, dannes en liten lysflekk med en veldefinert kontur på fokalplanet. utgjøres av stråledeleren. Stråledeleren sender fluorescensen direkte til detektoren. Det er et nålhull foran lyskilden og detektoren, henholdsvis kalt belysningsnålhullet og deteksjonsnålhullet. De geometriske dimensjonene til de to er de samme, omtrent 100-200 nm; i forhold til lysflekken på fokalplanet er de to konjugerte, det vil si at lysflekken passerer gjennom en rekke linser, og kan til slutt fokuseres på belysningsnålhullet og deteksjonsnålhullet samtidig. På denne måten kan lyset fra fokalplanet konsentreres innenfor deteksjonshullets rekkevidde, mens det spredte lyset ovenfra eller under fokalplanet blokkeres ut av deteksjonshullet og ikke kan avbildes. Prøven skannes punkt for punkt med laseren, og fotomultiplikatorrøret får etter å ha oppdaget pinhole også det konfokale bildet av det tilsvarende lyset punkt for punkt, som konverteres til et digitalt signal og overføres til datamaskinen, og til slutt aggregeres på skjermen til et klart konfokalt bilde av hele fokalplanet. .
Hvert fokalplanbilde er faktisk et optisk tverrsnitt av prøven, og dette optiske tverrsnittet har alltid en viss tykkelse, også kjent som en optisk skive. Siden lysintensiteten ved brennpunktet er mye større enn ved ikke-fokalpunktet, og lyset i ikke-fokalplanet filtreres ut av nålehullet, er dybdeskarpheten til det konfokale systemet omtrent null, og skanning langs Z-aksen kan realisere optisk tomografi, og danner Observer en todimensjonal optisk seksjon på det fokuserte stedet av prøven. Ved å kombinere XY-planet (fokalplan) skanning med Z-aksen (optisk akse) skanning, ved å akkumulere todimensjonale bilder av påfølgende lag og behandle med spesiell dataprogramvare, kan et tredimensjonalt bilde av prøven oppnås.
Det vil si at deteksjonsnålhullet og lyskildenålhullet alltid er fokusert på samme punkt, slik at fluorescensen eksitert utenfor fokuseringsplanet ikke kan komme inn i deteksjonsnålhullet.
Det enkle uttrykket for arbeidsprinsippet til konfokal laser er at den bruker en laser som lyskilde, og på grunnlag av tradisjonell fluorescensmikroskopavbildning, er en laserskanningsenhet og en konjugert fokuseringsenhet festet, og digital bildeoppsamling og prosessering. systemet styres av en datamaskin.
