Hvordan kan du velge riktig konfokalmikroskop for deg? Er det noen spesifikk metode?
Konfokalmikroskopi har flere fordeler enn bredfeltmikroskopi. Konfokal mikroskopi kan gjøre kontinuerlig optisk seksjonering av prøver og utelukke signalinterferens fra ikke-fokale plan. Av denne grunn er bruken av konfokalmikroskopi faktisk mer vanlig. Imidlertid er det flere og flere konfokale mikroskoper på markedet. Hvordan velge?
Konfokalmikroskopi har flere fordeler enn bredfeltmikroskopi. Konfokal mikroskopi kan lage kontinuerlige optiske seksjoner av prøver og utelukke signalinterferens fra ikke-fokale plan. Av denne grunn er konfokal mikroskopi faktisk mer vanlig. Imidlertid er det flere og flere konfokale mikroskoper på markedet. Hvordan velge? Når du velger et konfokalt mikroskop, er det to grunnleggende og viktige hensyn: hvilken type prøve du ønsker å studere (f.eks. faste eller levende celler), og hvilken type analyse du ønsker å utføre (f.eks. statiske eller dynamiske cellulære prosesser).
Konfokal avbildning av faste celler
For å avbilde faste og fargede celler eller vev, velger vi vanligvis laserskanning konfokal (LSCM). Dette er hovedsakelig fordi faste døde celler mangler raske biologiske hendelser i levende celler og kan bedre dra nytte av den høyere romlige oppløsningen til LSCM. LSCM-avbildning er å skjære prøven optisk med laser, og skannehastigheten (avhengig av hastigheten til skanningsarrayspeilet) er vanligvis 1 fps. Lengre eksponeringstider betyr en større risiko for fotobleking, men for faste døde celler er ikke tiden kritisk, og vi kan gjennomsnittlige den ved å ta flere bilder.
Konfokal avbildning av levende celler
Avbildning av levende celler krever ekstra beskyttelse mot uvennlige miljøer. Ved bildebehandling er vår første vurdering å opprettholde cellenes levedyktighet og helse. Varmeelementer med konstant temperatur og perfusjonssystemer er avgjørende, spesielt for time-lapse-studier. De raske biokjemiske hendelsene som kontrollerer den fysiologiske tilstanden til levende celler er det de fleste ønsker å studere, men disse hendelsene er for raske for konvensjonell LSCM. I tillegg induserte langvarig eksponering for LSCM også toksisk lysskade på celler. Derfor krever avbildning av levende celler spesielle konfokale mikroskoper.
Det er generelt to alternativer for konfokal avbildning av levende celler: hurtigskannende laserskanningskonfokaler og roterende diskkonfokaler. Rask skanningskonfokalmikroskopi erstatter langsommere galvanometerspeil med raskere resonansskanningsspeil, noe som muliggjør skannehastigheter på opptil 30 fps; mens spinnende diskkonfokale (SDCM-er) har fordelen av raskere skanning (selv om uunngåelig med tap av romlig oppløsning), kan hastigheten teoretisk nå 2000 fps (i praksis er den ofte begrenset av andre faktorer).
Hvis du er bekymret for fotobleking eller svært svakt fluorescenssignal, kan SDCM være mer egnet. SDCM bruker to roterende plater med oppsatte mikrobrønner for å spre eksitasjonslyset. I motsetning til LSCM, som skanner prøvepunktet, får SDCM flere punkter om gangen (ca. 100 pikselpunkter), så hastigheten økes kraftig, og fotobleking av SDCM og mindre fototoksisitet. Du kan imidlertid også bruke raske skanningskonfokaler for å øke skannehastigheten, kombinert med svært sensitive detektorer, og redusere eksitasjonslysenergien for å redusere fototoksisitet, noe som kan opprettholde de rike funksjonene til tradisjonelle konfokaler.
Automatisert konfokalt bildesystem
Noen forskere liker å finne måter å modifisere mikroskopet for å passe deres individuelle behov. Og noen forskere er ikke engang interessert i hvordan mikroskoper faktisk fungerer. For sistnevnte kan et automatisert konfokalmikroskop være mer til deres smak. For eksempel er Olympus FluoViewFV10i et slikt helautomatisk skrivebords-4-konfokalt lasermikroskop. Den kompakte integrerte strukturen krever nesten ingen installasjonsplass. Denne typen instrument er ideell for forskere som trenger å innhente mye bildedata hver dag, men de reflekterer selvfølgelig ikke fullt ut funksjonaliteten og fleksibiliteten til tradisjonelle konfokaler. I tillegg er NikonA1 også et helautomatisk konfokalsystem. Som de fleste konvensjonelle konfokale skanningsmikroskoper, bruker NikonA1 et galvanometer-skannehode, som har en høyere oppløsning enn A1R med et hybrid-skannehode, men en litt lavere hastighet (A1R ~30fps)
