Kunnskap om konfokalt fluorescensmikroskop
Grunnprinsippet for konfokal fluorescensmikroskopi: en punktlyskilde brukes til å bestråle prøven, og danner et lite, veldefinert lyspunkt på fokalplanet; fluorescensen som sendes ut fra dette punktet etter bestråling, samles opp av objektivlinsen og sendes tilbake langs den opprinnelige bestrålingslysbanen til strålesplitteren som består av et toveis kromatisk speil. Stråledeleren sender fluorescensen direkte til detektoren. Både lyskilden og detektoren har et nålhull foran seg, kalt henholdsvis belysningsnålhullet og deteksjonsnålhullet. Begge har samme geometri, omtrent 100-200 nm, og er konjugert med hensyn til lyspunktet på brennplanet, dvs. lyspunktet passerer gjennom en serie linser og kan til slutt fokuseres på både lysende og detektornålehull. På denne måten kan lys fra fokalplanet konvergere innenfor sondeåpningen, mens spredt lys ovenfra eller under brennplanet blokkeres utenfor sondeåpningen og ikke kan avbildes. Laseren skanner prøven punkt for punkt, og fotomultiplikatorrøret etter å ha oppdaget nålehullet får også det konfokale bildet av det tilsvarende lyset punkt for punkt, som konverteres til et digitalt signal og overføres til datamaskinen, og til slutt konvergerer til et klart lys. konfokalt bilde av hele fokalplanet på skjermen.
Hvert fokalplanbilde er faktisk et optisk tverrsnitt av prøven, og dette optiske tverrsnittet har alltid en viss tykkelse, også kjent som et optisk ark. Siden lysintensiteten ved brennpunktet er mye større enn den ved ikke-fokalpunktet, og lyset i ikke-fokalplanet filtreres ut av nålehullet, blir dybdeskarpheten til det konfokale systemet tilnærmet til null, og skanning langs Z-aksens retning gjør det mulig for optisk tomografi å danne en todimensjonal optisk skive av prøven som skal observeres ved brennpunktet. Ved å kombinere XY-plan (fokalplan) skanning med Z-akse (optisk akse) skanning, kan et tredimensjonalt bilde av prøven oppnås ved å akkumulere påfølgende lag med todimensjonale bilder, som behandles av spesialisert dataprogramvare.
Dette betyr at deteksjonsnålehullet og lyskildenålhullet alltid er fokusert på samme punkt, slik at fluorescens eksitert utenfor fokalplanet ikke kan komme inn i deteksjonsnålhullet.
Arbeidsprinsippet for laserkonfokal er ganske enkelt uttrykt at den bruker laser som en lyskilde, på grunnlag av tradisjonell fluorescensmikroskopavbildning, ekstra laserskanningsenhet og konjugert fokuseringsenhet, gjennom datamaskinkontroll for å utføre digitalt bildeinnsamling og prosesseringssystem.
