Kunnskap knyttet til konfokal fluorescensmikroskopi
Det grunnleggende prinsippet for konfokal fluorescensmikroskopi er å bruke en punktlyskilde for å bestråle prøven, og danner en veldefinert liten flekk på fokalplanet. Fluorescensen som sendes ut av flekken etter bestråling, samles opp av objektivlinsen og sendes tilbake til spektrofotometeret som består av et toveis fargespeil langs den opprinnelige bestrålingsbanen. Spektrofotometeret sender fluorescens direkte til detektoren. Det er to pinholes foran lyskilden og detektoren, henholdsvis kalt illumination pinholes og detection pinholes. De geometriske dimensjonene til de to er konsistente, omtrent 100-200nm; Sammenlignet med lyspunktet på fokalplanet, er de to konjugerte, noe som betyr at lyspunktet passerer gjennom en serie linser og kan til slutt fokusere på både belysningsnålhullet og deteksjonsnålhullet samtidig. På denne måten kan lys fra fokalplanet konvergere innenfor deteksjonshullets rekkevidde, mens spredt lys fra over eller under fokalplanet blokkeres utenfor deteksjonshullet og ikke kan avbildes. Ved å skanne prøven punkt for punkt med en laser, får fotomultiplikatorrøret etter å ha oppdaget pinhole også det tilsvarende konfokale bildet av lyset punkt for punkt, som omdannes til et digitalt signal og overføres til datamaskinen. Til slutt syntetiseres et tydelig konfokalt bilde av hele fokalplanet på skjermen.
Hvert fokalplanbilde er faktisk et optisk tverrsnitt av prøven, som alltid har en viss tykkelse, også kjent som en optisk tynn seksjon. På grunn av det faktum at lysintensiteten ved brennpunktet er mye større enn ved ikke-fokalpunktet, og lyset i ikke-fokalplanet filtreres ut av nålehull, er dybdeskarpheten til det konfokale systemet tilnærmet null. Skanning langs Z-aksens retning kan oppnå optisk tomografi, og danner en todimensjonal optisk skive ved brennpunktet til den observerte prøven. Ved å kombinere XY-plan (fokalplan) skanning med Z-akse (optisk akse) skanning, kan et tredimensjonalt bilde av prøven oppnås ved å akkumulere kontinuerlige lag med todimensjonale bilder og behandle dem med spesialisert dataprogramvare.
Deteksjonsnålhullet og lyskildenålhullet er alltid fokusert på samme punkt, slik at fluorescens eksitert utenfor fokuseringsplanet ikke kan komme inn i deteksjonsnålhullet.
Det enkle uttrykket for arbeidsprinsippet for laserkonfokalmikroskopi er at den bruker en laser som lyskilde, og legger til en laserskanningsenhet og en konjugert fokuseringsenhet på grunnlag av tradisjonell fluorescensmikroskopiavbildning. Det er et system som styres av en datamaskin for digital bildeinnsamling og -behandling.
