Lavpris fluorescens og lysfeltmikroskopdesign
Fluorescensmikroskopi er en metode som brukes til å visualisere
I denne guiden vil jeg gå gjennom det grunnleggende om fluorescensmikroskopi og hvordan man bygger tre forskjellige rimelige fluorescensmikroskoper. Disse systemene koster vanligvis tusenvis av dollar, men det har vært noen nyere forsøk på å gjøre dem mer tilgjengelige. Designene jeg presenterer her bruker en smarttelefon, dSLR og USB-mikroskop. Alle disse designene kan også brukes som lysfeltmikroskoper.
Trinn 1: Oversikt over fluorescensmikroskopi
For å forstå de grunnleggende konseptene for fluorescensmikroskopi, forestill deg en tett skog om natten, med trær, dyr, busker og andre levende skoger. Hvis du lyser en fakkel inn i skogen, vil du se alle disse strukturene og ha vanskelig for å visualisere bestemte dyr eller planter. Tenk deg at du bare er interessert i å se blåbærbusker i skogen. For å gjøre dette trener du ildfluen til å tiltrekkes kun av blåbærbusker, slik at når du ser på skogen er det bare blåbærbuskene som lyser opp. Man kan si at man bruker ildfluer til å merke blåbærbusker slik at man kan se blåbærstrukturer i skogen.
I denne analogien representerer skogen hele prøven, blåbærbuskene representerer strukturene du ønsker å visualisere (f.eks. spesifikke celler eller subcellulære organeller), og ildfluene er fluorescerende forbindelser. Å belyse fakkelen alene uten ildfluene ligner på lysfeltmikroskopi.
Det neste trinnet er å forstå den grunnleggende funksjonen til fluorescerende forbindelser (også kjent som fluoroforer). Fluoroforer er faktisk små objekter (nanoskala) designet for å koble sammen spesifikke strukturer i en prøve. De absorberer et smalt område av bølgelengder av lys og sender ut en annen bølgelengde med lys. For eksempel kan en fluorofor absorbere blått lys (dvs. at fluoroforen eksiteres av blått lys) og deretter sende ut grønt lys på nytt. Dette er vanligvis oppsummert med eksitasjons- og emisjonsspektra (over). Disse diagrammene viser bølgelengden til lyset absorbert av fluoroforen og bølgelengden til lyset som sendes ut av fluoroforen.
Mikroskopdesignet er veldig likt det til et normalt lysfeltmikroskop, med to hovedforskjeller. For det første må lyset som belyser prøven være på bølgelengden som eksiterer fluoroforen (for eksempelet ovenfor er lyset blått). For det andre trenger mikroskopet bare å samle det utsendte lyset (grønt lys) mens det blokkerer det blå lyset. Dette er fordi blått lys er overalt, men grønt lys kommer kun fra bestemte strukturer i prøven. For å blokkere blått lys har mikroskoper vanligvis noe som kalles et langpassfilter som lar grønt lys passere uten blått lys. Hvert langpassfilter har en avskjæringsbølgelengde. Hvis lyset har en bølgelengde som er lengre enn avskjæringsbølgelengden, kan det passere gjennom filteret. Derav navnet, "langpass". Kortere bølgelengder er blokkert.
Trinn 2: Modellering av mikroskopet med optisk optikk
Dette er et ekstra trinn til de grunnleggende prinsippene for mikroskopdesign. Det er ikke nødvendig å bygge et fluorescensmikroskop, så du kan hoppe over det hvis du ikke vil fordype deg i optikk.
Både lysfelt- og fluorescensmikroskoper kan modelleres ved bruk av stråleoptikk. Den grunnleggende forutsetningen for stråleoptikk er at lys oppfører seg på samme måte som lys som reiser bort fra en lyskilde. Når du ser deg rundt i et rom, ser du lys fra sollys utenfor et vindu eller fra en lyspære. Lyset blir da absorbert eller reflektert av gjenstander i rommet. Noe av det reflekterte lyset får det til å rettes mot øynene dine. Hvis objektet er opplyst, kan du forestille deg at hvert punkt på objektet sender ut lys i alle retninger (over). Linsen, som linsen i øynene våre, fokuserer lyset til et punkt slik at vi kan se objektet. Uten linse fortsetter lyset å bevege seg utover og danner ikke et bilde.
Så hvordan lager vi optiske systemer som forstørrer små objekter? For å forstå designet trenger du egentlig bare å kjenne to ligninger: den tynne linseavbildningen og forstørrelseslikningene:
1/f=1/si + 1/så
M=-si/so
f er brennvidden til objektivet. En kortere brennvidde betyr at objektivet har mer fokuseringskraft.
Det samme gjelder for objektavstand; avstanden mellom linsen og objektet (f.eks. et tre).
si er bildeavstanden; avstanden mellom linsen og der bildet dannes
M er forstørrelse; hvor stort bildet er i forhold til objektet. For mikroskop ønsker vi å øke forstørrelsen.
For en fullstendig opplæring om ligningen med tynne linser, sjekk ut denne Khan Academia-videoen. I gif-en ovenfor kan du se at avstanden objektet beveger seg nærmere linsen øker bildeavstanden, noe som øker forstørrelsen. Den vertikale linjen med to piler indikerer linsen.
