Prinsipp og anvendelse av fluorescensmikroskopi
(1) Prinsippet og de strukturelle egenskapene til fluorescensmikroskopet: fluorescensmikroskopet bruker en punktlyskilde med høy lyseffektivitet for å sende ut lys med en viss bølgelengde (som ultrafiolett lys 3650 tommer eller lilla blått lys 4200 tommer) gjennom filtersystemet som eksitasjonslyset for å begeistre prøven. Etter at det fluorescerende stoffet inni avgir fluorescens i forskjellige farger, observeres det gjennom forstørrelsen av objektivlinsen og okularet. På denne måten, under en sterk kontrastbakgrunn, selv om fluorescensen er veldig svak, er den lett å identifisere og har høy følsomhet. Den brukes hovedsakelig til forskning på cellestruktur og funksjon og kjemisk sammensetning. Den grunnleggende strukturen til et fluorescensmikroskop er sammensatt av et vanlig optisk mikroskop pluss noe tilbehør (som en fluorescerende lyskilde, et eksitasjonsfilter, en tofarget stråledeler og et blokkeringsfilter, etc.). Fluorescerende lyskilde - bruk vanligvis ultrahøytrykks kvikksølvlampe (50-200W), som kan sende ut lys med forskjellige bølgelengder, men hvert fluorescerende stoff har en eksitasjonsbølgelengde som produserer den sterkeste fluorescensen, så det er nødvendig å legge til en eksitasjonsfilter (Vanligvis er det ultrafiolette, lilla, blå og grønne eksitasjonsfiltre), som bare lar eksitasjonslys med en viss bølgelengde passere gjennom og bestråle prøven, mens de absorberer annet lys. Etter at hvert stoff er bestrålet med eksitasjonslys, avgir det synlig fluorescens med lengre bølgelengde enn bestrålingsbølgelengden på svært kort tid. Fluorescens er spesifikk og generelt svakere enn eksitasjonslys. For å observere spesifikk fluorescens, kreves det et blokkerende (eller undertrykkende) filter bak objektivlinsen. Den har to funksjoner: den ene er å absorbere og blokkere eksitasjonslyset fra å komme inn i okularet, for ikke å forstyrre fluorescensen og skade øynene; den andre er å velge og la den spesifikke fluorescensen passere gjennom, og vise en spesifikk fluorescerende farge. De to filtrene må brukes sammen.
Det er to typer fluorescensmikroskoper når det gjelder deres optiske veier:
1. Transmisjonsfluorescensmikroskop: Eksitasjonslyskilden eksiterer fluorescens gjennom prøvematerialet gjennom kondensatorlinsen. En mørk feltsamler brukes vanligvis, og en vanlig solfanger kan også brukes til å justere speilet slik at eksitasjonslyset sendes og forbigås til prøven. Dette er et gammeldags fluorescensmikroskop. Fordelen er at fluorescensen er sterk ved lav forstørrelse, og ulempen er at fluorescensen avtar med økningen av forstørrelsen. Derfor er det bedre å observere større prøvematerialer.
2. Epi-fluorescensmikroskop Dette er en ny type fluorescensmikroskop utviklet i moderne tid. Forskjellen er at eksitasjonslyset faller fra objektivlinsen til overflaten av prøven, det vil si at den samme objektivlinsen brukes som belysningskondensatoren og objektivlinsen for å samle fluorescens. En dikroisk stråledeler må legges til i lysbanen, som er 45 grader unna det lette uranet. Eksitasjonslyset reflekteres inn i objektivlinsen og samles på prøven. Fluorescensen generert av prøven og eksitasjonslyset som reflekteres av linseoverflaten til objektivlinsen og dekkglassoverflaten går inn i objektivlinsen samtidig, og går tilbake til tofargestråledeleren for å gjøre eksitasjonslyset atskilt fra fluorescens , gjenværende eksitasjonslys absorberes av blokkerende filtre. Hvis du bytter til en kombinasjon av ulike eksitasjonsfiltre/tofarge stråledelere/blokkeringsfiltre, kan behovene til ulike fluorescerende reaksjonsprodukter dekkes. Fordelen med denne typen fluorescensmikroskop er at belysningen av synsfeltet er jevn, avbildningen er klar, og jo større forstørrelsen er, desto sterkere er fluorescensen.
(2) Hvordan bruke fluorescensmikroskopet.
1. Slå på lyskilden, kvikksølvlampen med ultrahøytrykk må varmes opp i noen minutter for å nå det lyseste punktet.
2. For transmisjonsfluorescensmikroskopet bør det nødvendige eksitasjonsfilteret installeres mellom lyskilden og kondensatoren, og det tilsvarende blokkeringsfilteret skal installeres bak objektivlinsen. Epi-fluorescensmikroskoper må sette inn det nødvendige eksitasjonsfilteret/dobbeltfargestråledeleren/blokkeringsfilterinnsatsene i sporene i lysbanen.
3. Observer med en linse med lav forstørrelse, og juster midten av lyskilden i henhold til justeringsanordningen til forskjellige typer fluorescensmikroskop slik at den er plassert i midten av hele belysningspunktet.
4. Plasser prøvearket og observer etter fokusering. Vær oppmerksom under bruk: Ikke observer direkte med endefilteret, for ikke å skade øynene; når du observerer prøven med en oljelinse, må en spesiell oljelinse uten fluorescens brukes; etter at høytrykkskvikksølvlampen er slått av, kan den ikke slås på igjen umiddelbart, og den må testes. Den kan startes på nytt etter 5 minutter, ellers vil den være ustabil og påvirke levetiden til kvikksølvlampen.
(3) Observasjon Ved å bruke et blåfiolett lysfilter under et fluorescerende mikroskop på undervisningsplattformen, kan det ses at cellene farget med o,01 prosent akridin oransje fluorescerende fargestoff, blir kjernen og cytoplasmaet begeistret for å produsere to forskjellige farger av fluorescens (mørk) grønn og oransje-rød).
