Prinsipper for konfokal mikroskopi
Konfokalt mikroskop er et høypresisjons avbildningsinstrument som dukket opp og utviklet på 1980-tallet, og er et essensielt vitenskapelig forskningsinstrument for å studere submikronstrukturer. Med utviklingen av datamaskiner, bildebehandlingsprogramvare og lasere har også konfokale mikroskoper gjennomgått en stor utvikling, og er nå mye brukt innen biologi, mikrosystemer og materialmåling. Konfokalmikroskop er en ny type mikroskop som integrerer konfokalt prinsipp, skanneteknologi og datagrafikkbehandlingsteknologi. Dens viktigste fordeler er: høy sideoppløsning og høy aksial oppløsning, og effektiv undertrykking av strølys, med høy kontrast.
Et typisk konfokalt mikroskopoppsett er å plassere to små hull på det konjugerte planet til fokalplanet til det målte objektet, hvorav det ene er plassert foran lyskilden og det andre er plassert foran detektoren, som vist i figuren. 1. Det kan sees fra figuren at når den målte prøven er i kvasi-fokusplanet, er lysintensiteten samlet av deteksjonsenden størst; når den målte prøven er i ufokusert posisjon, diffunderer lysflekken ved deteksjonsenden og lysintensiteten avtar raskt. Derfor kan bare lyset som sendes ut av punkter på fokalplanet passere gjennom utgangsnålhullet, mens lyset som sendes ut av punkter utenfor fokalplanet er ufokusert på utgangsnålplanet, og de fleste av dem kan ikke passere gjennom det sentrale nålehullet. Derfor ser observasjonsmålpunktet på fokalplanet lyst ut, og ikke-observasjonspunktet fremstår som svart som bakgrunn, noe som øker kontrasten og fjerner bildet. Under avbildningsprosessen er de to nålhullene konfokale, konfokalpunktet er det detekterte punktet, og planet der det detekterte punktet befinner seg er det konfokale planet.
Størrelsen på nålhullet ved detektoren i konfokalmikroskopi spiller en kritisk rolle. Det påvirker oppløsningen og signal-til-støy-forholdet til systemet direkte. Hvis nålehullet er for stort, vil den konfokale deteksjonseffekten ikke oppnås, noe som ikke bare reduserer oppløsningen til systemet, men også introduserer mer strølys; hvis nålhullet er for lite, vil det redusere deteksjonseffektiviteten og redusere det mikroskopiske bildet. lysstyrke. Studier har vist at når diameteren på nålhullet er lik diameteren til Airy-skiven, oppfylles de konfokale kravene, og deteksjonseffektiviteten reduseres ikke vesentlig. Siden diameteren til nålehullet generelt er i størrelsesorden mikron, vil signalforvrengning oppstå hvis det er et avvik mellom laserstrålens fokuspunkt og posisjonen til nålehullet. Derfor bruker konfokale mikroskoper generelt et autofokussystem, som praktisk talt øker måletiden.
Siden det laserkonfokale skanningsmikroskopet er en punktavbildning, er det nødvendig å bruke todimensjonal skanning i x- og y-retningene for å få et todimensjonalt bilde av objektet. Ulike mikroskoper bruker forskjellige skannemetoder:
(1) Objektskanning. Det vil si at selve objektet beveger seg i henhold til en viss lov, mens lysstrålen forblir uendret. Fordeler: stabil optisk vei; Ulemper: et stort skannebord er nødvendig, så skannehastigheten er sterkt begrenset.
(2) Et stråleskanningssystem dannes ved å bruke et reflekterende galvanometer. Det vil si at ved å kontrollere skanningsgalvanometeret, reflekteres den fokuserte lysflekken regelmessig til et bestemt lag av objektet for å fullføre todimensjonal skanning. Fordelen er at den har høy presisjon og brukes ofte til høypresisjonsmåling. Skannehastigheten er forbedret i forhold til objektskanning, men den er fortsatt ikke rask.
(3) Bruk det akusto-optiske avbøyningselementet for skanning, og skanningen realiseres ved å endre utgangsfrekvensen til lydbølgen og deretter endre overføringsretningen til lysbølgen. Den enestående fordelen er at skannehastigheten er veldig rask. Skannesystemet utviklet av USA bruker en akusto-optisk deflektor for å generere sanntids videobilder. Det tar bare 1/30s å skanne et todimensjonalt bilde, og det oppnår nesten sanntidsutgang.
(4) Nipkow diskskanning. Skanneprosessen fullføres ved å rotere Nipkow-disken mens andre komponenter holdes i ro. Det kan avbildes på en gang, og hastigheten er veldig høy. Siden bildestrålen er lys utenfor aksen, må imidlertid avviket utenfor aksen til linsen korrigeres, og utnyttelsesgraden av lysenergi er svært lav.
