Tekniske egenskaper og bruksferdigheter til to-foton fluorescensmikroskop
To-foton fluorescensmikroskopi er en ny teknologi som kombinerer laserskanning konfokal mikroskopi og to-foton eksitasjonsteknologi.
Grunnprinsippet for to-fotoneksitasjon er: ved høy fotontetthet kan fluorescerende molekyler absorbere to langbølgelengdefotoner samtidig, og sende ut et kortere bølgelengdefoton etter en kort periode med såkalt eksitert tilstandslevetid . ; Effekten er den samme som å bruke et foton med en bølgelengde som er halvparten av den lange bølgelengden for å eksitere et fluorescerende molekyl. To-foton-eksitasjon krever høy fotontetthet. For ikke å skade celler, bruker to-fotonmikroskopi høyenergimoduslåste pulslasere. Laseren som sendes ut av denne laseren har høy toppenergi og lav gjennomsnittsenergi, pulsbredden er bare 100 femtosekunder, og perioden kan nå 80 til 100 megahertz. Når du bruker en objektivlinse med høy numerisk blenderåpning for å fokusere fotonene til den pulserende laseren, er fotontettheten i fokuspunktet til objektivlinsen høyest, og to-foton-eksitasjonen skjer kun i fokuspunktet til objektivlinsen, så to-foton-mikroskopet trenger ikke et konfokalt nålehull, noe som forbedrer effektiviteten for fluorescensdeteksjon. Det er en viktig forskningsmetode innen morfologi, molekylær cellebiologi, nevrovitenskap og farmakologi.
1. Bakgrunnen for fremveksten av to-fotonmikroskopi - to begrensninger ved tradisjonell laserkonfokalmikroskopi:
1) Det ene er fototoksisitetsfenomenet: fordi det konfokale nålehullet må være lite nok til å få et høyoppløselig bilde, og den lille blenderåpningen vil blokkere en stor del av fluorescensen som sendes ut fra prøven, inkludert fluorescensen som sendes ut fra fokalplanet, det tilsvarende Ja, eksitasjonslyset må være sterkt nok til å oppnå et tilstrekkelig signal-til-støy-forhold; og høyintensitetslaseren vil føre til at det fluorescerende fargestoffet falmer raskt under kontinuerlig skanning, og det fluorescerende signalet vil bli svakere og svakere ettersom skanningen skrider frem.
2) Fototoksisitet er et annet problem. Under laserbestråling vil mange fluorescerende fargestoffmolekyler produsere cytotoksiner som singlet oksygen eller frie radikaler, så skannetiden og den optiske krafttettheten til eksitasjonslyset bør begrenses i eksperimentet for å opprettholde prøvetettheten. aktiv. I forskningen på aktive prøver, spesielt de ulike stadiene av vekst og utvikling av aktive prøver, gjør fotobleking og fototoksisitet disse studiene svært begrensede.
2. Hvorfor sier du at to-fotonmikroskoper generelt ikke trenger å være utstyrt med ultrafiolette eksitasjonslasere?
To-fotonmikroskopi er en fluorescenseksitasjonsteknologi basert på to-fotoneksitasjonseffekten: fluorescerende fargestoffmolekyler kan eksiteres ved å absorbere to lavenergifotoner samtidig (tidsintervallet mellom to fotoner som når fluorescerende molekyler er mindre enn 1 femtosekund ), kan eksitasjonseffekten tilsvare å absorbere et høyenergifoton med 1/2 bølgelengde. For eksempel, å absorbere to fotoner ved røde bølgelengder tilsvarer et molekyl som absorberer ultrafiolett. Langbølgelengdefotoner blir ikke lett absorbert av celler, så fototoksisitet for levende celler reduseres, og fotobleking reduseres også. På denne måten spiller den ikke bare funksjonen til ultrafiolett eksitasjon, men unngår også skade av ultrafiolett lys på prøven.
3. Hva er spesielt med laseren til to-fotonmikroskop?
Sannsynligheten for to-fotonabsorpsjon avhenger av hvor tett de to innfallende fotonene sammenfaller i rom og tid (de to fotonene må ankomme innen 10-18 sekunder). To-fotonabsorpsjonstverrsnittet er lite, og bare fluoroforer i områder med stor fotonfluks eksiteres. Derfor er de fleste av laserne som brukes titan safir lasere, som kan oppnå picosekund eller femtosekund skanningshastigheter, og har svært høy toppeffekt og lav gjennomsnittlig effekt, slik at fotobleking og fototoksisitet kan reduseres eller elimineres. Det viktigste er å gi en veldig høy tetthet av fotoner i et lite område, som kan sikre samtidig eksitasjon av to fotoner.
4. Hva er fordelene med to-foton eksitasjon?
1) Øk selektiviteten til fargestoffet: eksitasjonslysområdet til den konfokale systemlaseren (Ar, Ar/Kr, HeNe) er 488nm - 647nm. Dette betyr å eksperimentere med UV-eksiterte fluorescerende fargestoffer, f.eks. med DAPI , Hoescht. Eksitasjonsbølgelengden til to-foton er dobbelt så stor som for enkeltfoton, så fargestoffer eksitert av ultrafiolett kan eksiteres av nær-infrarødt lys.
2) Reduser fotobleking: På grunn av reduksjonen i fotobleking øker suksessraten for eksperimenter som bruker CFP/YFP for fluorescensresonansenergioverføring (FRET).
3) Ingen spesiell objektivlinse er nødvendig: Fra maskinvaresynspunkt krever eksiteringen av UV-eksiterte fargestoffer med bølgelengden til nær-infrarødt lys ikke spesielle UV-optiske komponenter.
4) Forbedre signal-til-støy-forholdet: eksitasjonslysbølgelengden og den utsendte lysbølgelengden har en stor forskjell, noe som forbedrer signal-til-støyforholdet.
5) Bleking lokalisert til brennpunktet: Siden fluorescenseksitasjon bare skjer ved fokuspunktet til objektivet, er det ikke behov for et konfokalt nålehull. Dette forbedrer lysdeteksjonen og fotobleking forekommer kun i fokuspunktet.
6) Lettere å penetrere prøver: Infrarødt bølgelengdelys spres ikke lett av celler og kan penetrere dypere prøver.
5. Sammenlignet med laserskannende konfokalmikroskopi, hva er den største forbedringen gjort med to-fotonmikroskopi?
1) Redusert fotobleking.
2) Redusert fototoksisitet.
3) Det er ikke lett å strø, og det er lettere å trenge gjennom tykke prøver, som hjerneskiver.
