Den viktigste observasjonsmetoden for optisk mikroskop er fluorescensobservasjon
Fluorescensfenomen
Fluorescens refererer til prosessen der et fluorescerende stoff avgir lys med lengre bølgelengde nesten samtidig når det bestråles med lys med en bestemt bølgelengde (Figur 1). Når lys med en bestemt bølgelengde (eksitasjonsbølgelengde) treffer et molekyl (som et molekyl i en fluorofor), absorberes fotonenergien av molekylets elektroner. Deretter går elektronene over fra grunntilstanden (S0) til et høyere energinivå, den eksiterte tilstanden (S1'). Denne prosessen kalles eksitasjon①. Elektronet forblir i eksitert tilstand i 10-9–10-8 sekunder, hvor elektronet mister litt energi ②. I prosessen med å forlate den eksiterte tilstanden (S1) og gå tilbake til grunntilstanden ③, vil den gjenværende energien som absorberes under eksitasjonsprosessen bli frigjort.
Oppholdstiden til et fluorescerende molekyl i eksitert tilstand er fluorescenslevetiden, vanligvis i nanosekunder, som er en iboende egenskap for selve det fluorescerende molekylet. Teknologien for avbildning ved bruk av fluorescenslevetid kalles Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), som kan utføre mer dyptgående funksjonelle og nøyaktige målinger i tillegg til fluorescensintensitetsavbildning for å oppnå molekylær konformasjon, intermolekylære interaksjoner og molekylære mikromiljøer. informasjon som er vanskelig å få tak i med konvensjonell optisk bildebehandling.
En annen viktig egenskap ved fluorescens er Stokes-skiftet, forskjellen i bølgelengde mellom eksitasjons- og emisjonstoppene (figur 2). Vanligvis er emisjonslysbølgelengden lengre enn eksitasjonslysbølgelengden. Dette er fordi etter at det fluorescerende stoffet er eksitert og før fotonet frigjøres, vil elektronene miste en del av energien gjennom avspenningsprosessen. Fluorescerende stoffer med større Stokes-skift er lettere å observere under et fluorescensmikroskop.
Fluorescensmikroskoper og fluorescensfilterblokker
Fluorescensmikroskopi er et optisk mikroskop som bruker fluorescensegenskaper for å observere og avbilde, og er mye brukt innen cellebiologi, nevrobiologi, botanikk, mikrobiologi, patologi, genetikk og andre felt. Fluorescensavbildning har fordelene med høy sensitivitet og høy spesifisitet, og er svært egnet for observasjon av fordelingen av spesifikke proteiner, organeller osv. i vev og celler, studiet av samlokalisering og interaksjon, og sporing av livsdynamikk prosesser som endringer i ionekonsentrasjon.
De fleste molekyler i celler fluorescerer ikke, og for å se dem må de være fluorescerende merket. Det er mange metoder for fluorescerende merking, som kan merkes direkte (som bruk av DAPI for å merke DNA), eller immunfarging ved bruk av antigenbindende egenskaper til antistoffer, eller målproteinet kan merkes med fluorescerende proteiner (som GFP, grønn) fluorescerende protein), eller reversibel binding. syntetiske fargestoffer (som Fura-2) osv.
For tiden har fluorescensmikroskopet blitt standard bildebehandlingsutstyr for ulike laboratorier og bildeplattformer, og det er en god hjelper for våre daglige eksperimenter. Fluorescensmikroskoper er hovedsakelig delt inn i tre kategorier: stående fluorescensmikroskop (egnet for seksjonering), inverterte fluorescensmikroskoper (egnet for levende celler, tatt i betraktning snitt), fluorescerende stereoskopiske mikroskoper (egnet for større prøver, som planter, sebrafisk (voksen-/ embryo), medaka, mus/rotteorganer, etc.).
Fluorescensfilterblokken er kjernekomponenten i fluorescensavbildning i mikroskop. Den består av et eksitasjonsfilter, et emisjonsfilter og en dikroisk stråledeler. Den er installert i filterhjulet, for eksempel Leica DMi8 utstyrt med et 6-posisjonsfilterhjul (Figur 3). ). Ulike mikroskoper har forskjellige hjulposisjoner, og noen mikroskoper bruker filterglass.
Filterblokken spiller en viktig rolle i fluorescensavbildning: eksitasjonsfilteret velger eksitasjonslyset for å eksitere prøven og blokkerer andre bølgelengder av lys; lyset som passerer gjennom eksitasjonsfilteret passerer gjennom en dikroisk strålesplitter (dets rolle er å reflektere eksitasjonslyset og overføre fluorescensen), Etter refleksjon blir det fokusert av objektivlinsen, bestrålet til prøven, og den tilsvarende fluorescensen eksiteres til avgir lys. Det utsendte lyset samles opp av objektivlinsen, passerer gjennom den dikroiske stråledeleren og når emisjonsfilteret. Som vist i figur 4: eksitasjonsbølgelengden er 450-490nm, den dikroiske stråledeleren reflekterer lys som er kortere enn 510nm, transmitterer lys lengre enn 510nm, og emisjonslysmottaksområdet er 520-560nm.
Fluorescensfiltre som vanligvis brukes i fluorescensmikroskoper kan deles inn i to typer: langpass (LP for kort) og båndpass (BP for kort). Båndpasset bestemmes vanligvis av den sentrale bølgelengden og bredden på intervallet, for eksempel 480/40, som betyr at lys fra 460-500nm kan passere. Langpassfiltre, for eksempel 515 LP, sender lys med bølgelengder lengre enn 515 nm (Figur 5).
Fluorescerende stoffer har sin karakteristiske eksitasjons (absorpsjon) kurve og emisjonskurve, eksitasjonstoppen er den ideelle eksitasjonsbølgelengden (høy eksitasjonseffektivitet, som kan redusere eksitasjonslysenergien, beskytte celler og fargestoffer), og emisjonskurven er emisjonsfluorescensbølgelengden område. Derfor vil vi i eksperimentet velge bølgelengden så nær eksitasjonstoppen som mulig for eksitasjon, og mottaksområdet må inkludere emisjonstoppen. For eksempel er eksitasjonstoppen til Alexa Fluor 488 500nm, og eksitasjonsfilteret på 480/40 kan velges i fluorescensmikroskopet.
Detaljer om filterkubene kan sees i mikroskopavbildningsprogramvaren. Å forstå fargestoffer og finne filteret som passer best til prøven din er avgjørende for fluorescensavbildning. Spektralinformasjonen til fluorescerende fargestoffer og fluorescerende proteiner er generelt angitt i instruksjonene, og kan også finnes på nettet.
I tillegg til eksitasjons- og emisjonsbølgelengdene til fluorescerende prober, må valget av filterblokker også vurdere om det er ikke-spesifikk eksitasjon og om det er kryssfarge for flerfargemerkede prøver. I tillegg er det nødvendig å vurdere den fluorescerende lyskilden som brukes. For tiden inkluderer de ofte brukte fluorescerende lyskildene kvikksølvlamper, metallhalogenlamper og LED-lyskilder som har utviklet seg raskt de siste årene. Spekteret til en fluorescerende lyskilde er kontinuerlig eller diskontinuerlig, og energien vil være forskjellig i forskjellige bølgelengdebånd. LED-lyskilden blir gradvis den viktigste lyskilden til fluorescensmikroskop på grunn av dets relativt smale spektralbånd, mer stabil energiutgang, lang levetid, tryggere og miljøvern og mange andre fordeler.
I tillegg til den innebygde filterblokken til mikroskopet er det også et eksternt hurtighjul (Figur 7). Konverteringshastigheten til filteret ved siden av det eksterne hurtighjulet til Leica er 27 ms, som kan realisere høyhastighets flerfargeeksperimenter, for eksempel FRET- og Fura2-forhold kalsiumavbildning. (fig. 8) et al.
Et bredt utvalg av fluorescensmikroskopi avbildningsteknikker
For å møte ulike behov for fluorescensavbildning, er det i tillegg til fluorescensmikroskoper utviklet ulike fluorescensmikroskopiavbildningsløsninger:
Wide-field HD-bildesystemer, som Leica THUNDER Imager, bruker Leicas innovative Clearing-teknologi for å effektivt fjerne ikke-fokusplaninterferenssignaler under bildebehandling, og presentere klare bilder og fordelene med høyhastighetsbildebehandling;
Det konfokale laserskanningsmikroskopet bruker nålehull for å eliminere interferens fra ikke-fokalplanet, realiserer optisk seksjonering og oppnår høyoppløselige bilder og tredimensjonale bilder;
Ultrahøyoppløselige mikroskoper og nanomikroskoper som bryter gjennom diffraksjonsgrensen kan observere fine strukturer mindre enn 200 nm;
Et multifotonavbildningssystem som bruker prinsippet om multifotoneksitasjon for avbildning av tykt vev og dypt in vivo;
Light sheet imaging-teknologi med høy tidsmessig og romlig oppløsning, rask bildehastighet, høy oppløsning, lav fototoksisitet, spesielt egnet for forskning på utvikling og in vivo dynamisk observasjon;
Fluorescence lifetime imaging (FLIM), som ikke påvirkes av faktorer som fluorescerende substanskonsentrasjon, fotobleking, eksitasjonslysintensitet, etc., kan utføre mer dyptgående funksjonelle og nøyaktige målinger;
Fluorescenskorrelasjonsspektroskopi (FCS) og fluorescenskrysskorrelasjonsspektroskopi (FCCS), måler molekyltallet og diffusjonskoeffisienten til fluorescerende molekyler, og analyserer derved molekylkonsentrasjon, molekylstørrelse, viskositet, molekylær bevegelse, molekylære binding/dissosiasjon og molekylære optiske egenskaper;
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF), med ekstremt høy z-akseoppløsning, er ideell for å studere den molekylære strukturen og dynamikken til cellemembranoverflater.
