Den viktigste observasjonsmetoden for optisk mikroskop er fluorescensobservasjon
Fluorescens refererer til prosessen der et fluorescerende stoff avgir lys med lengre bølgelengde nesten samtidig når det bestråles med lys av en bestemt bølgelengde (Figur 1). Når lys med en bestemt bølgelengde (eksitasjonsbølgelengde) treffer et molekyl, slik som de i en fluorofor, absorberes fotonenergien av molekylets elektroner. Deretter går elektronene over fra grunntilstanden (S0) til et høyere energinivå, den eksiterte tilstanden (S1'). Denne prosessen kalles eksitasjon①. Elektronet forblir i eksitert tilstand i 10-9–10-8 sekunder, hvor elektronet mister litt energi②. Under prosessen med at elektroner forlater den eksiterte tilstanden (S1) og går tilbake til grunntilstanden③, frigjøres den gjenværende energien som absorberes under eksitasjonsprosessen.
Oppholdstiden til det fluorescerende molekylet i eksitert tilstand er fluorescenslevetiden, som vanligvis er på nanosekundnivå, og er en iboende egenskap for selve det fluorescerende molekylet. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), som bruker fluorescence lifetime imaging-teknologi, kalles fluorescence lifetime imaging (FLIM). I tillegg til fluorescensintensitetsavbildning, kan mer dyptgående funksjonelle og nøyaktige målinger oppnås for å oppnå molekylær konformasjon, intermolekylære interaksjoner og mikromiljøet til molekyler. Informasjon som er vanskelig å få tak i med konvensjonell optisk bildebehandling.
En annen viktig egenskap ved fluorescens er Stokes-skiftet, forskjellen i bølgelengde mellom eksitasjons- og emisjonstoppene (figur 2). Vanligvis er emisjonsbølgelengden lengre enn eksitasjonsbølgelengden. Dette er fordi elektroner vil miste deler av energien sin gjennom avslapningsprosessen etter at det fluorescerende stoffet er eksitert og før de frigjør fotoner. Fluorescerende stoffer med større Stokes-skift er lettere å observere under et fluorescensmikroskop.
Fluorescensmikroskopi og fluorescensfilterkuber
Fluorescensmikroskop er et optisk mikroskop som bruker fluorescensegenskaper for observasjon og avbildning, og er mye brukt innen ulike felt som cellebiologi, nevrobiologi, botanikk, mikrobiologi, patologi og genetikk. Fluorescensavbildning har fordelene med høy sensitivitet og høy spesifisitet, og er svært egnet for observasjon av fordelingen av spesifikke proteiner og organeller i vev og celler, studiet av kolokalisering og interaksjon, sporing av livsdynamiske prosesser som ionekonsentrasjonsendringer , etc.
De fleste molekyler i celler fluorescerer ikke, og for å se dem må de være fluorescerende merket. Det er mange metoder for fluorescerende merking, for eksempel direkte merking (som bruk av DAPI for å merke DNA), eller immunfarging ved bruk av antigenbindende egenskaper til antistoffer, eller bruk av fluorescerende proteiner (som GFP, grønt fluorescerende protein) for å merke målproteiner , og vendbar binding. Syntetiske fargestoffer (som Fura-2) og så videre.
For tiden har fluorescensmikroskopet blitt standard bildebehandlingsutstyr for ulike laboratorier og bildeplattformer, og er en god hjelper for våre daglige eksperimenter. Fluorescensmikroskoper er hovedsakelig delt inn i tre kategorier: stående fluorescensmikroskop (egnet for skjæring), inverterte fluorescensmikroskoper (egnet for levende celler, tatt i betraktning skjæring), fluorescerende stereoskop (egnet for større prøver, som planter, sebrafisk (voksen/embryo) ), medaka, mus/rotteorganer, etc.).
Fluorescensfilterblokk er kjernekomponenten i mikroskopfluorescensavbildning. Den består av tre deler: eksitasjonsfilter, emisjonsfilter og dikroisk stråledeler. Den er installert i filterhjulet. For eksempel er Leica DMi8 utstyrt med et 6-posisjonsfilterhjul (fig. 3). Antall posisjoner til forskjellige mikroskophjul vil være forskjellige, og noen mikroskoper bruker filterblokkglass.
Filterblokken spiller en viktig rolle i fluorescensavbildning: eksitasjonsfilteret velger eksitasjonslyset for å eksitere prøven, og blokkerer lys med andre bølgelengder; lyset som passerer gjennom eksitasjonsfilteret passerer gjennom det dikroiske speilet (dets funksjon er å reflektere eksitasjonslyset og overføre fluorescensen), Etter refleksjon fokuseres det av objektivlinsen, bestråler prøven og eksiterer den tilsvarende fluorescensen, dvs. , avgitt lys. Det utsendte lyset samles opp av objektivlinsen, passerer gjennom den dikroiske stråledeleren og når emisjonsfilteret. Som vist i figur 4: eksitasjonsbølgelengden er 450-490nm, det dikroiske speilet reflekterer lys kortere enn 510nm, sender lys lengre enn 510nm, og mottaksområdet for utsendt lys er 520-560nm.
