Bestemmelse av antall mikroorganismer - mikroskopets direkte tellemetode!
Bakteriell populasjonsvekst manifesteres ved en økning i celleantall eller en økning i cellemasse. Metodene for å bestemme antall celler inkluderer direkte mikroskoptellingsmetode, platekolonitellingsmetode, fotoelektrisk oljeforholdsmetode, maksimal sannsynlighetsmetode og membranfiltreringsmetode. Metodene for å måle cellestoff inkluderer bestemmelse av celletørrvekt, bestemmelse av visse cellulære komponenter som nitrogen-, RNA- og DNA-innhold, og bestemmelse av metabolitter. Kort sagt er det mange metoder for å måle vekst av mikroorganismer, hver med sine fordeler og ulemper, og bør velges i henhold til den spesifikke situasjonen. Dette eksperimentet introduserer hovedsakelig mikroskop-direktetellingsmetoden som vanligvis brukes i produksjon og vitenskapelig forskning.
1. Formålskrav
1. Tydeliggjør prinsippet for antall blodceller.
2. Mestre metoden for å telle mikroorganismer ved hjelp av en blodcelleteller.
2. Grunnleggende prinsipper
Mikroskop direkte tellemetode er en enkel, rask og intuitiv metode for å direkte telle en liten mengde suspensjon av prøven som skal testes på et spesielt glassglass med et visst areal og volum (også kjent som en bakterieteller). Metoder. For tiden er de mest brukte bakterietellerne i inn- og utland: blodcelleteller, Peteroff-Hauser bakterieteller og Hawksley bakterieteller osv. De kan brukes til telling av gjær, bakterier, muggsporer og andre suspensjoner, og det grunnleggende prinsippet er det samme. De to sistnevnte typene bakterietellere har et totalt volum på 0.02 mm3 etter å ha blitt dekket med et dekkglass, og avstanden mellom dekkglasset og objektglasset er bare 0,02 mm, så oljen nedsenkingsobjektivlinse kan brukes til å observere og observere små celler som bakterier. telle. I tillegg til disse bakteriometrene finnes det også en estimeringsmetode for forholdet mellom arealet av utstryket og arealet av synsfeltet observert direkte under mikroskopet, som vanligvis brukes til bakteriologisk undersøkelse av melk. Fordelene med mikroskop direkte tellemetoden er intuitiv, rask og enkel å betjene. Ulempen med denne metoden er imidlertid at det målte resultatet vanligvis er summen av døde og levende celler. For tiden er det noen metoder for å overvinne denne mangelen, for eksempel kombinasjonen av levedyktige bakterier som farger mikrokammerkultur (kort tid) og tilsetning av celledelingshemmere for å oppnå formålet med å telle bare levedyktige bakterier.
I dette forsøket ble et hemocytometer brukt som eksempel for direkte mikroskopisk telling. For bruk av de to andre typene bakterietellere, se instruksjonene til hver produsent. Å telle direkte under mikroskopet med et hemocytometer er en vanlig metode for å telle mikroorganismer. Telleplaten er en spesiell glassglide, hvor tre plattformer er dannet av fire spor; den bredere plattformen i midten er delt i to halvdeler av en kort tverrgående spalte, og det er et gitter på hver side av plattformen. Hvert rutenett er delt inn i ni store ruter, og den store firkanten i midten er tellerom. Strukturen til blodcelletelleplaten er vist i figur l{{{{10}}}}. Skalaen til tellerommet har generelt to spesifikasjoner, den ene er en stor firkant delt inn i 25 midterste ruter, og hver midterste rute er delt inn i 16 små ruter (Figur 15-2); den andre er en stor firkant. Ruten er delt inn i 16 midterste ruter, og hver midterste rute er delt inn i 25 små ruter, men uansett hva slags tellebrett det er, er det 400 små ruter i hver stor rute. Sidelengden til hver stor firkant er 1 mm, og arealet til hver stor firkant er 1 mm2. Etter tildekking med dekkglass er høyden mellom dekkglasset og skyveglasset 0,1 mm, så volumet til tellekammeret er 0,lmm3 (en tusendels milliliter). Figur 15-1 Strukturen til tellebrettet for blodceller (1) Figur 15-2 Strukturen til tellebrettet for blodceller (2) A. Sett forfra; B. Lengdesnitt; Det forstørrede rutenettet, den store firkanten i midten er tellekammer 1. Blodceller Telleplate; 2. Dekkglass; 3. Når du teller i tellekammeret, teller du vanligvis det totale antallet bakterier i fem kvadrater, beregner deretter gjennomsnittet av hver kvadrat, og multipliserer med 25 eller 16 for å få Det totale antallet bakterier i en stor firkant konverteres deretter til totalt antall bakterier i 1 ml bakterieoppløsning. La det totale antallet bakterier i de fem rutene være A, og fortynningsforholdet til bakterieløsningen til å være B. Hvis det er en telleplate med 25 ruter, er det totale antallet bakterier i 1 mL bakterieløsning {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(stykker) På samme måte, hvis det er en telleplate med 16 mellomstore firkanter, totalt antall bakterier i 1mL bakterieløsning=A/ 5×16×104×B=32000A·B (stykker)
3. Utstyr
1. Bakterier
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumenter eller andre redskaper
Hemocytometer, mikroskop, dekkglass, steril kapillær dropper.
4. Driftstrinn
1. Fremstilling av bakteriesuspensjon
Saccharomyces cerevisiae ble fremstilt til en bakteriesuspensjon med passende konsentrasjon med sterilt fysiologisk saltvann.
2. Mikroskop tellerom
Før du legger til prøver, mikroskopisk inspiser tellekammeret på telleplaten. Hvis det er skitt, må det rengjøres og tørkes før telling.
3. Legg til prøve
Dekk det rene og tørre hemocytometeret med et dekkglass, og bruk deretter en steril kapillærdråpe for å slippe en liten dråpe av den rystede Saccharomyces cerevisiae-suspensjonen fra kanten av dekkglasset, og la bakterieløsningen automatisk bevege seg langs gapet ved kapillær osmose. Inn i tellerommet kan det generelle tellerommet fylles med bakterievæske. Ved prøvetaking, rist først bakterieoppløsningen; ved tilsetting av prøver skal det ikke dannes luftbobler i tellekammeret.
4. Mikroskoptelling
Etter å ha tilsatt prøven, stå stille i 5 minutter, plasser deretter hemocytometeret på mikroskopet, finn først plasseringen av tellekammeret med et laveffektmikroskop, og bytt deretter til et høyeffektmikroskop for telling. Juster intensiteten på mikroskoplyset på riktig måte. For mikroskoper som bruker speil til belysning, vær oppmerksom på ikke å avvike fra den ene siden av lyset, ellers vil det ikke være lett å se de firkantede linjene i tellerommet tydelig i synsfeltet, eller bare vertikale linjer eller horisontale linjer vil bli sett. Hvis det viser seg at bakterieløsningen er for konsentrert eller for fortynnet før telling, er det nødvendig å justere fortynningen på nytt før telling. Vanligvis krever prøvefortynningen omtrent 5 til 10 bakterier i hver liten celle. Hvert tellekammer velger 5 midtceller (valgfritt 4 hjørner og en midtcelle i midten) for telling. Cellene på rutenettet telles vanligvis bare på de øvre og høyre linjene. Ved gjærspirer, når størrelsen på knoppen når halvparten av modercellen, regnes den som to bakterieceller. For å telle en prøve, beregne bakterieinnholdet i prøven ved å beregne gjennomsnittsverdien fra de to tellekamrene.
5. Vask blodcelletallet
Etter bruk, skyll blodcelletelleren med vann i springen, ikke skrubb med harde gjenstander, og tørk den selv eller med hårføner etter vask. Mikroskopisk undersøkelse for å observere om det er rester av bakterier eller andre sedimenter i hver liten celle. Hvis det ikke er rent, må det vaskes gjentatte ganger til det er rent.
