Forskjellen mellom positiv og negativ fasekontrast i et mikroskop
Avhengig av konfigurasjonen og naturen til faseringen plassert ved objektivets bakre fokalplan, kan prøver observeres i positiv eller negativ fasekontrast. Denne interaktive opplæringen studerer forholdet mellom surround (S), diffraksjon (D) og resulterende lyse partikler (P-bølger), samt positiv og negativ fasekontrastmikroskopi. I tillegg presenteres også faseplatens geometri og representative eksempelbilder.
Når folk bruker det i sitt arbeid nå, er de fleste av forskerne i den negative forskjellen, og nå spiller ikke den positive forskjellen stor rolle i det nåværende vitenskapelige forskningsarbeidet.
Opplæringen initialiserer fasebildet med en tilfeldig valgt prøve som vises i vinduet Fasekontrastbilde, og det tilsvarende bølgeforholdet vises i venstre nabo til bildevinduet. For å bruke opplæringen, bruk musepekeren til å flytte oversettelsen mellom positiv og negativ fasekontrast eller glidebryteren for lysfasekontrastmodus. Når glidebryteren er oversatt, endrer bildene som vises i fasekontrastbildevinduet hvordan prøven vises i gjeldende bildebehandlingsmodus angitt av glidebryteren. Under kurvegrafen er det også en faseplate som endrer form for å matche bildemodusen valgt av glidebryteren. For å se en ny prøve, bruk rullegardinmenyen Valgt prøve for å velge en annen prøve.
Et plott av faseplatekonfigurasjonen, bølgeforhold og vektorer assosiert med generering av positive og negative fasekontrastbilder er presentert i figur 1. Eksempler på prøver avbildet med disse teknikkene er også vist. I en positiv fasekontrast optisk konfigurasjon (øvre rad av bildet i figur 1), passerer surround (S)-bølgefronten gjennom faseplaten, noe som resulterer i en netto faseforskyvning på 180 graders fasefremgang, med 1/4 bølgelengde ( 1 halv bølgelengde). Avanserte surround-bølgefronter er nå i stand til å delta i destruktiv interferens med diffrakterte (D) bølger i det mellomliggende bildeplanet. I de fleste tilfeller er det bare å fremme den relative fasen til den omkringliggende bølgefronten alene ikke tilstrekkelig til å resultere i generering av høykontrastbilder i Nikon-mikroskoper. Dette er fordi amplituden til surroundbølgene er betydelig større enn de diffrakterte bølgene, og undertrykker det resulterende bildet produsert av interferens fra en brøkdel av det totale antallet bølger. For å redusere den omkringliggende bølgefronten til en verdi nærmere amplituden til de diffrakterte bølgene (og utføre interferens i bildeplanet), oppnås opasiteten i faseringen til objektivet ved å bruke et semi-transparent metall (nøytral økende tetthet) ) belegg Gulv. De omgivende lysbølgene, som passerer nesten fullstendig gjennom faseringen ved design, under fasekontrastmikroskopi, reduseres betydelig i amplitude av opasiteten til faseplaten til en verdi i området 10 til 30 prosent av den opprinnelige intensiteten.
Fordi den resulterende partikkelbølgen produseres av interferensen* av de omkringliggende og diffrakterte bølgefrontene, er amplituden til partikkelbølgen (P) produsert av interferensen mellom bølgefrontene som ankommer bildeplanet nå mye mindre enn den omkringliggende når du er i Sexual densitetsbelegg påført. Nettoeffekten er å konvertere den relative faseforskjellen som introduseres ved passasje av lys som kommer fra bildeplanet gjennom prøven til en forskjell i amplitude (intensitet). Fordi det menneskelige øyet vil tolke forskjellen i intensitet som en kontrast, er prøven nå synlig i mikroskopokularet og kan også fanges på membranen med konvensjonelle kamerasystemer, eller digitalt, ved hjelp av CCD- eller CMOS-enheter. Alle positive fasekontrastsystemer fremmer selektivt fasen til den lineære surround (S)-bølgefronten i forhold til den sfæriske diffrakterte (D) bølgefronten. Prøver med høyere brytningsindeks enn det omkringliggende mediet ser mørkere ut på en nøytral grå bakgrunn, mens de med en lavere brytningsindeks enn svømmemediet ser lysere ut enn den grå bakgrunnen.
For å modifisere den romlige separasjonen av de diffrakterte bølgefrontene som omgir fasen og amplituden i et fasekontrastoptisk system, har en rekke faseplatekonfigurasjoner blitt introdusert. Fordi faseplaten er plassert ved eller svært nær objektivets bakre fokalplan (diffraksjonsplan), må alt lys som passerer gjennom mikroskopet reise gjennom denne komponenten. Den delen av faseplaten i kondensatorens ringformede fokus kalles det konjugerte området, mens det gjenværende området kalles det komplementære området. Det konjugerte området inneholder materialet som er ansvarlig for å endre fasen til det omgivende (udiffrakterte) lyset med enten pluss eller minus 90 grader i forhold til den diffrakterte bølgefronten. Generelt er det fasekonjugerte ringområdet bredere (omtrent 25 prosent) enn området definert av det kondenserende ringbildet for å redusere mengden av omgivende lys som forplanter seg til det komplementære området.
De fleste faseplater tilgjengelig fra moderne mikroskopprodusenter er en av de som er fremstilt ved vakuumavsetning av tynne dielektriske og metalliske filmer på en glassplate eller montert direkte på linseoverflaten til mikroskopobjektivet. Rollen til den dielektriske filmen er å fase lyset, mens metallfilmen demper intensiteten til det udiffrakterte lyset. Noen produsenter bruker flere anti-reflekterende belegg kombinert med filmen for å redusere mengden gjenskinn og refleksjon av strølys tilbake i det optiske systemet. Hvis faseplaten ikke er dannet på overflaten av en linse, sementeres den vanligvis mellom påfølgende linser som befinner seg på fokalplanet nær baksiden av objektivet. Tykkelsen og brytningsindeksen til de dielektriske, metall- og antirefleksjonsbeleggene, så vel som de til den optiske sementen, er nøye valgt for å frembringe ønsket faseskift mellom de komplementære og konjugerte områdene av faseplaten. I optiske termer kalles en faseplate som endrer fasen i forhold til det omgivende lyset for å diffraktere lys med 90 grader (enten positiv eller negativ) en kvartbølgeplate på grunn av den optiske baneforskjellseffekten på den.
En oversikt over den positive fase-inverse er vist i figur 1. Positiv-fase kontrastplaten (venstre side av figur 1) driver frem surroundbølgen, med 1/4 bølgelengde, på grunn av erosjonsringen i glassplaten, som kan reduseres med det øvre passet i høyindeksplaten. Bølgen fysiske banen tatt. På grunn av interaksjon med prøven, når de diffrakterte prøvestrålene (D) er forsinket, er den optiske baneforskjellen mellom de omsluttende og diffrakterte bølgene som kommer ut fra faseplaten halv bølgelengde med 1/4 bølgelengde. Nettoresultatet er en 180-graders optisk baneforskjell mellom de omgivende og diffrakterte bølgene, noe som resulterer i destruktiv interferens for prøver med høy brytningsindeks mellom bildeplanene. Amplitudekurven for positiv fase motsatt destruktiv interferensbølge er vist i den øvre grafen i figur 1. Den resulterende partikkelbølgen (P) har en lavere amplitude enn surround (S)-bølgen, og får dermed objektet til å se ut sammenlignet med en relativt sett mørkere bakgrunn. Nederst, bilde av Zygnema-grønnalger vist til høyre (merket DL). Vektoren representert av fremdriften til 1/4-bølgelengden, som er vist som en 90-grads roterende surroundbølge mot klokken i positiv fasekontrast, vises mellom figuren og bildet i figur 1.
Alternativt kan mikroskopoptikken også fremstilles for å produsere en negativ fase motsatt, som vist i den nedre delen av figur 1, i hvilket tilfelle surround (S)-bølgene er forsinket (i stedet for som avansert) med en kvart bølgelengde i forhold til den ene diffrakterte (D) bølgen. Som et resultat ser prøver med høye brytningsindekser lysere ut mot en mørkere grå bakgrunn (se det nederste bildet merket BM i figur 1). I negativ fase motsatt inneholder objektivfaseplaten en hevet ring som forsinker fasen (i stedet for å fremme fasen som positiv fase motsatt), og passerer en kvart bølgelengde i forhold til fasen til den diffrakterte bølgen som den nulte ordens surroundbølgen. Fordi de diffrakterte bølgene har blitt forsinket med en kvart bølgelengde når de passerer gjennom prøven, elimineres den optiske veiforskjellen mellom de omgivende og diffrakterte bølgene og prøven med høy brytningsindeks interfererer konstruktivt i bildeplanet. Merk at den resulterende partikkelbølgen (P) har høyere amplitude enn surround-bølgen (S) i negativ fasekontrast. Det er også vist en negativ faserevers, hvor omløpsbølgevektoren går gjennom en 90 graders rotasjon med klokken av vektordiagrammet.
