Forskjellen mellom et fluorescensmikroskop og et normalt mikroskop
Jeg prøvde nylig å lage noen frosne deler av mus. Deretter skal jeg bruke et fluorescensmikroskop for å se om viruset jeg injiserte er i hjerneområdet jeg ønsker. Noen grunnleggende prinsipper for fluorescensmikroskopi må læres kort, og jeg vil dele dem her.
Fluorescensmikroskoper bruker ultrafiolett lys som en lyskilde for å belyse objektet som inspiseres, noe som får objektet til å sende ut lys, og deretter observere objektet under mikroskopet. Den brukes hovedsakelig til immunfluorescensceller. Den består hovedsakelig av en lyskilde, et filterplatesystem og et optisk system. Det fluorescerende bildet av prøven observeres gjennom forstørrelsen av okularet og objektivet. La oss ta en titt på forskjellen mellom et fluorescensmikroskop og et vanlig optisk mikroskop.
1. Se på belysningsmetoden
Belysningsmetoden til fluorescensmikroskop er generelt epi-illumination, som betyr at lyskilden plasseres på testprøven gjennom objektivlinsen.
2. Se på oppløsningen
Fluorescensmikroskoper bruker ultrafiolett lys som lyskilde, som har kortere bølgelengde, men høyere oppløsning enn vanlige optiske mikroskoper.
3. Forskjeller i filtre
Fluorescensmikroskoper bruker to spesielle filtre, ett som brukes foran lyskilden for å filtrere ut synlig lys, og ett som brukes mellom objektivlinsen og okularet for å filtrere ut ultrafiolette stråler, som kan beskytte menneskelige øyne.
Fluorescensmikroskop er også en type optisk mikroskop. Hovedårsaken er at bølgelengden eksitert av fluorescensmikroskop er kort, så dette fører til forskjell i struktur og bruk mellom fluorescensmikroskop og vanlig mikroskop. De fleste fluorescensmikroskoper har god funksjon for å fange svakt lys. , så dens avbildningsevne er også god under ekstremt svak fluorescens. Sammen med den kontinuerlige forbedringen av fluorescensmikroskoper de siste årene, har støyen også blitt kraftig redusert. Derfor brukes flere og flere fluorescensmikroskoper.
Kunnskap om to-foton fluorescensmikroskopi
Grunnprinsippet for to-foton-eksitasjon er: under betingelser med høy fotontetthet kan fluorescerende molekyler absorbere to langbølgelengdefotoner samtidig, og etter en kort såkalt eksitert tilstandslevetid sende ut et foton med kortere bølgelengde . ;Effekten er den samme som å bruke et foton med en bølgelengde som er halvparten av den lange bølgelengden for å eksitere fluorescerende molekyler. To-foton-eksitasjon krever en høy fotontetthet. For ikke å skade celler bruker to-fotonmikroskoper høyenergimoduslåste pulslasere. Denne laseren sender ut laserlys med høy toppenergi og lav gjennomsnittsenergi, med en pulsbredde på kun 100 femtosekunder og en frekvens på 80 til 100 MHz. Når du bruker et objektiv med høy numerisk blenderåpning for å fokusere fotonene til den pulserende laseren, er fotontettheten i fokuset til objektivlinsen høyest. To-foton-eksitasjon skjer bare i fokuset til objektivlinsen, så to-foton-mikroskopet krever ikke et konfokalt nålehull, noe som forbedrer effektiviteten av fluorescensdeteksjon.
I det generelle fluorescensfenomenet, på grunn av den lave fotontettheten til eksitasjonslyset, kan et fluorescerende molekyl bare absorbere ett foton på samme tid og deretter sende ut ett fluorescensfoton gjennom en strålingsovergang. Dette er enkeltfotonfluorescens. For fluorescenseksitasjonsprosessen ved bruk av laser som lyskilde, kan to-foton eller til og med multi-foton fluorescensfenomener forekomme. I dette tilfellet er intensiteten til eksitasjonslyskilden som brukes høy, og fotontettheten oppfyller kravet til at de fluorescerende molekylene skal absorbere to fotoner samtidig. I prosessen med å bruke vanlige lasere som eksitasjonslyskilder er fotontettheten fortsatt ikke nok til å produsere to-fotonabsorpsjon. Femtosekund-pulslasere brukes vanligvis, og deres øyeblikkelige kraft kan nå megawattnivået. Derfor er bølgelengden til to-foton-fluorescens kortere enn bølgelengden til eksitasjonslyset, som tilsvarer effekten produsert av halveksitasjonsbølgelengde-eksitasjon.
