Funksjoner og anvendelser av konfokal lasermikroskopi
Laser scanning confocal microscope (LSCM) er en type mikroskop designet basert på konjugert fokusteknologi, det vil si å gjøre laserlyskilden, prøven som testes og detektoren alle i konjugert posisjon til hverandre.
Fundamental
I generelle mikroskoper faller fokalplanet til objektivlinsen sammen med detektoren slik at det observerte bildeplanet er isolert fra det tilstøtende aksiale planet, mens i konfokale mikroskoper belyses prøven ved å bruke en diffraksjonsbegrenset lysflekk, og i Denne isolasjonseffekten oppnås ved å bruke et nålhull i oppsamlingslysbanen ved fokuspunktet til punktkonjugatet for å filtrere strølys for å forbedre oppløsningen.
Bildefunksjoner
Bare lyset som reflekteres tilbake fra det konjugerte prøvelaget kan passere gjennom det lille hullet i oppsamlingslysbanen, og de gjenværende irrelevante prøvelagsrefleksjonene blokkeres av det lille hullet. Dette kan resultere i en betydelig økning i oppløsning. Nedenfor er en side-ved-side-sammenligning av multidimensjonal fluorescensmikroskopi og konfokalmikroskopi av den samme tykke prøven. Når en serie bilder tas ved forskjellige fokalplan, kan det som vanligvis refereres til som en "z-stack" genereres, og dette bildet viser både oppløsnings- og kontrastforsterkningene som tilbys av konfokalmikroskopi og de underliggende årsakene til disse gevinstene. Undersøkelse av bildet på toppen av stabelen med bildeplanet over vevet avslører mye spredt lys i fluorescensbildet, mens det konfokale bildet virker svart. Denne reduksjonen i PSF i aksial retning er direkte ansvarlig for forskjellen i oppløsning observert ved det optiske grensesnittet i midten av z-stakken.
En annen funksjon ved laserskanningskonfokalmikroskopi er at det er en skanningsteknologi. Den tradisjonelle bredfeltsbelysningsteknologien belyser hele prøven, slik at bildet kan fanges direkte med det blotte øye eller en detektor, men LSCM bruker en stråle eller flere fokuserte stråler passerer gjennom prøven for skanning og avbildning, og det resulterende bildet er kalt en optisk seksjon. Følgende viser forskjellen mellom den tradisjonelle bredfeltsbelysningsmetoden og laserskanningsmetoden for konfokal belysning.
Derfor er en praktisk arbeidsmetode for et moderne konfokalmikroskop vist i figuren nedenfor. Eksitasjonslyset som sendes ut av laseren passerer gjennom et dikroisk speil og skanner i x- og y-retningene til prøven gjennom et par vibrerende speil. Eksitasjonen (eller refleksjonen) av prøven. Lyset kommer inn i PMT-detektoren gjennom nålehullet og registreres, og det registrerte skannebildet rekonstrueres av datamaskinen for å oppnå det faktiske prøvebildet.
