Fluorescensmikroskop relatert kunnskap
Grunnprinsippet for konfokal fluorescensmikroskopi: en punktlyskilde brukes til å bestråle prøven, og en veldefinert liten lysflekk dannes på fokalplanet. sammensatt av splittere. Stråledeleren sender fluorescensen direkte til detektoren. Det er et nålhull foran lyskilden og detektoren, henholdsvis kalt belysningsnålhullet og deteksjonsnålhullet. Den geometriske størrelsen på de to er den samme, omtrent 100-200nm; i forhold til lysflekken på fokalplanet er de to konjugerte, det vil si at lysflekken passerer gjennom en rekke linser, og kan til slutt fokuseres på belysningsnålhullet og deteksjonsnålhullet samtidig. På denne måten kan lyset fra fokalplanet konvergeres innenfor deteksjonshullets omfang, mens det spredte lyset ovenfra eller under fokalplanet blokkeres utenfor deteksjonshullet og ikke kan avbildes. Laseren skanner prøven punkt for punkt, og fotomultiplikatorrøret etter å ha oppdaget nålehullet får også det konfokale bildet av det tilsvarende lyset punkt for punkt, som konverteres til et digitalt signal og overføres til datamaskinen, og til slutt aggregeres til en klar konfokalt bilde av hele fokalplanet på skjermen.
Hvert fokalplanbilde er faktisk et optisk tverrsnitt av prøven, og dette optiske tverrsnittet har alltid en viss tykkelse, også kjent som en optisk tynn seksjon. Siden lysintensiteten ved brennpunktet er mye større enn ved ikke-fokuspunktet, og lyset i ikke-fokalplanet filtreres av nålehullet, er dybdeskarpheten til det konfokale systemet omtrent null, og skanner langs Z -aksen kan realisere optisk tomografi, som danner en Observer den todimensjonale optiske seksjonen på det fokuserte stedet av prøven. Ved å kombinere XY-plan (fokalplan) skanning med Z-akse (optisk akse) skanning, kan det tredimensjonale bildet av prøven oppnås ved å akkumulere todimensjonale bilder av kontinuerlige lag og behandles av spesiell dataprogramvare.
Det vil si at deteksjonsnålhullet og lyskildenålhullet alltid er fokusert på samme punkt, slik at fluorescensen eksitert utenfor fokalplanet ikke kan komme inn i deteksjonsnålhullet.
Det enkle uttrykket for arbeidsprinsippet til laserkonfokal er at den bruker laserlys som lyskilde. På grunnlag av tradisjonell fluorescensmikroskopavbildning, legger den til en laserskanningsenhet og en konjugert fokuseringsenhet, og det er et system for digital bildeinnsamling og prosessering gjennom datakontroll.
