Fluorescensmikroskopi skiller seg fra konvensjonell mikroskopi
Fluorescensmikroskoper bruker ultrafiolett lys som lyskilde for å bestråle objektet som skal inspiseres, slik at objektet sender ut lys, og deretter observere objektet under mikroskopet. Den brukes hovedsakelig til immunfluorescensceller. Den er hovedsakelig sammensatt av en lyskilde, et filterplatesystem og et optisk system for å observere det fluorescerende bildet av prøven gjennom forstørrelsen av okularet og objektivlinsen. La oss ta en titt på forskjellen mellom dette fluorescensmikroskopet og et vanlig optisk mikroskop.
1. Se på belysningsmetoden
Lysmetoden til fluorescensmikroskopet er generelt episkopisk, det vil si at lyskilden projiseres på testprøven gjennom objektivlinsen.
2. Se på oppløsningen
Fluorescensmikroskoper bruker ultrafiolett lys som lyskilde, og bølgelengden er relativt kort, men oppløsningen er høyere enn for vanlige optiske mikroskoper.
3. Forskjellen i filteret
Fluorescensmikroskoper bruker to spesielle filtre, som brukes foran lyskilden for å filtrere ut synlig lys, og brukes mellom objektivlinsen og okularet for å filtrere ut ultrafiolette stråler, som kan beskytte menneskelige øyne.
Fluorescensmikroskop er også et slags optisk mikroskop, hovedsakelig fordi bølgelengden eksitert av fluorescensmikroskopet er kort, så dette fører til forskjellen i struktur og bruk mellom fluorescensmikroskopet og det vanlige mikroskopet. De fleste av fluorescensmikroskopene har en god funksjon for å fange svakt lys, så under ekstremt svak fluorescens er også bildeevnen god. Sammen med den kontinuerlige forbedringen av fluorescensmikroskoper de siste årene, har støyen også blitt kraftig redusert. Derfor brukes flere og flere fluorescensmikroskoper.
par
Kunnskap om fotonfluorescensmikroskopi
Grunnprinsippet for to-foton-eksitasjon er: ved høy fotontetthet kan fluorescerende molekyler absorbere to langbølgelengdefotoner samtidig, og sende ut et kortere bølgelengdefoton etter en kort såkalt eksitert tilstandslevetid; effekten er den samme som å bruke et foton med bølgelengde halvparten av langbølgelengden for å eksitere fluorescerende molekyler. To-foton-eksitasjon krever høy fotontetthet. For ikke å skade celler, bruker to-fotonmikroskopi høyenergimoduslåste pulslasere. Laseren som sendes ut av denne laseren har høy toppenergi og lav gjennomsnittsenergi, pulsbredden er bare 100 femtosekunder, og frekvensen kan nå 80 til 100 megahertz. Når du bruker en objektivlinse med høy numerisk blenderåpning for å fokusere fotonene til den pulserende laseren, er fotontettheten ved brennpunktet til objektivlinsen høyest, og to-fotoneksitasjon skjer kun ved brennpunktet til objektivlinsen, så to-foton mikroskop krever ikke et konfokalt nålehull, noe som forbedrer effektiviteten for fluorescensdeteksjon.
I generelle fluorescensfenomener, på grunn av den lave fotontettheten til eksitasjonslyset, kan et fluorescerende molekyl bare absorbere ett foton på samme tid, og deretter sende ut et fluorescerende foton gjennom en strålingsovergang, som er enkeltfotonfluorescens. For fluorescenseksitasjonsprosessen ved bruk av laser som lyskilde, kan to-foton eller til og med multi-foton fluorescens forekomme. På dette tidspunktet er intensiteten til eksitasjonslyskilden som brukes høy, og fotontettheten oppfyller kravene til fluorescerende molekyler som absorberer to fotoner samtidig. I prosessen med å bruke en generell laser som eksitasjonslyskilde, er fotontettheten fortsatt ikke nok til å produsere to-foton-absorpsjonsfenomenet. Vanligvis brukes en femtosekund pulserende laser, og dens øyeblikkelige kraft kan nå størrelsesorden megawatt. Derfor er bølgelengden til to-foton-fluorescens kortere enn bølgelengden til eksitasjonslys, som tilsvarer effekten produsert av eksitasjon ved halve eksitasjonsbølgelengden.
To-foton fluorescensmikroskopi har mange fordeler:
1) Lys med lang bølgelengde påvirkes mindre av spredning enn lys med kort bølgelengde og trenger lett gjennom prøven;
2) De fluorescerende molekylene utenfor fokalplanet er ikke eksitert, slik at mer eksitasjonslys kan nå fokalplanet, slik at eksitasjonslyset kan trenge dypere prøver;
3) Nær-infrarødt lys med lang bølgelengde er mindre giftig for celler enn lys med kort bølgelengde;
4) Når du bruker et to-fotonmikroskop for å observere prøver, forekommer fotobleking og fototoksisitet kun i fokalplanet. Derfor er to-fotonmikroskopi mer egnet enn enkeltfotonmikroskopi for å observere tykke prøver, for å observere levende celler eller for spotfotoblekeeksperimenter.
Kunnskap om konfokal fluorescensmikroskopi
Grunnprinsippet for konfokal fluorescensmikroskopi: prøven bestråles av en punktlyskilde, og en liten, veldefinert lysflekk dannes på fokalplanet. Etter at punktet er bestrålet, samles fluorescensen som sendes ut av objektivlinsen og sendes tilbake til stråledeleren som består av et dikroisk speil langs den opprinnelige belysningsbanen. Stråledeleren sender fluorescensen direkte til detektoren. Det er et nålhull foran lyskilden og detektoren, henholdsvis kalt belysningsnålhullet og deteksjonsnålhullet. Den geometriske størrelsen på de to er den samme, omtrent 100-200nm; i forhold til lysflekken på fokalplanet er de to konjugerte, det vil si at lysflekken passerer gjennom en serie linser, og kan til slutt fokuseres på belysningsnålhullet og deteksjonsnålhullet samtidig. På denne måten kan lyset fra fokalplanet konvergeres innenfor deteksjonshullets omfang, mens det spredte lyset ovenfra eller under fokalplanet blokkeres utenfor deteksjonshullet og ikke kan avbildes. Laseren skanner prøven punkt for punkt, og fotomultiplikatorrøret etter å ha oppdaget nålehullet får også det konfokale bildet av det tilsvarende lyset punkt for punkt, som konverteres til et digitalt signal og overføres til datamaskinen, og til slutt aggregeres til en klar konfokalt bilde av hele fokalplanet på skjermen.
Hvert fokalplanbilde er faktisk et optisk tverrsnitt av prøven, og dette optiske tverrsnittet har alltid en viss tykkelse, også kjent som en optisk tynn seksjon. Siden lysintensiteten ved brennpunktet er mye større enn ved ikke-fokuspunktet, og lyset i ikke-fokalplanet filtreres ut av nålehullet, er dybdeskarpheten til det konfokale systemet omtrent null, og skanner langs Z-aksen kan realisere optisk tomografi, og danner en todimensjonal optisk skive på det fokuserte stedet av prøven som skal observeres. Ved å kombinere XY-plan (fokalplan) skanning med Z-akse (optisk akse) skanning, kan det tredimensjonale bildet av prøven oppnås ved å akkumulere todimensjonale bilder av kontinuerlige lag og behandles av spesiell dataprogramvare.
Det vil si at deteksjonsnålhullet og lyskildenålhullet alltid er fokusert på samme punkt, slik at fluorescensen eksitert utenfor fokalplanet ikke kan komme inn i deteksjonsnålhullet.
Det enkle uttrykket for arbeidsprinsippet til laserkonfokal er at den bruker laserlys som lyskilde. På grunnlag av tradisjonell fluorescensmikroskopavbildning, legger den til en laserskanningsenhet og en konjugert fokuseringsenhet, og det er et system for digital bildeinnsamling og prosessering gjennom datakontroll.
