Introduksjon til fluorescensmikroskopi
Fluorescensmikroskopi er å bestråle objektet farget med fluorescein med lys med kort bølgelengde, slik at det blir begeistret for å produsere fluorescens med lang bølgelengde, og deretter observert. I et fluorescensmikroskop må eksitasjonslyset med en spesifikk bølgelengde velges fra belysningslyset til prøven for å generere fluorescens, og deretter må fluorescensen skilles fra det blandede lyset fra eksitasjonslyset og fluorescens for observasjon. Derfor spiller filtersystemet en ekstremt viktig rolle i valg av en spesifikk bølgelengde. Fluorescensmikroskoper er mye brukt innen biologi, medisin og andre felt.
1. Hovedkomponentene i fluorescensmikroskopet:
(A) Lyskilde: Lyskilden utstråler lys med forskjellige bølgelengder (fra ultrafiolett til infrarødt). de
(B) Lyskilde for eksitasjonsfilter: gjennom lyset med en spesifikk bølgelengde som kan få prøven til å produsere fluorescens, mens den blokkerer lys som er ubrukelig for spennende fluorescens. de
(C) Fluorescerende prøver: vanligvis farget med fluorescerende pigmenter. de
(D) Blokkerende filter: blokker eksitasjonslyset som ikke absorberes av prøven og overfører selektivt fluorescensen, og noen bølgelengder overføres selektivt i fluorescensen.
de
2. Klassifisering av fluorescensmikroskoper:
Fluorescensmikroskoper er generelt delt inn i to typer: transmisjon og epi-emisjon:
en. Transmisjonstype: eksitasjonslyset kommer fra bunnen av objektet som skal inspiseres, og kondensatoren er en mørkfeltskondensator, slik at eksitasjonslyset ikke kommer inn i objektivlinsen, men fluorescensen kommer inn i objektivlinsen. Det er lyst ved lave forstørrelser, men mørkt ved høye forstørrelser. Det er vanskelig å operere i oljenedsenking og sentrering. Det er spesielt vanskelig å bestemme lysområdet ved lave forstørrelser, men det kan få en veldig mørk synsfeltbakgrunn. Overføringstypen brukes ikke for ugjennomsiktige objekter. de
b. Epi-type: Transmisjonstypen er nesten eliminert for tiden. De fleste av de nye fluorescensmikroskopene er epi-type. Lyskilden kommer ovenfra objektet som skal inspiseres, og det er en stråledeler i den optiske banen, så den egner seg for både transparente og ugjennomsiktige objekter som skal inspiseres. Siden objektivlinsen fungerer som en kondensatorlinse, er den ikke bare enkel å betjene, men kan også oppnå jevn belysning av hele synsfeltet fra lav forstørrelse til høy forstørrelse. de
de
3. Forholdsregler for fluoroskopi
en. Langvarig bestråling av eksitasjonslys vil forårsake fluorescensdemping og slukking, så forkort observasjonstiden så mye som mulig, og bruk en baffel for å dekke eksitasjonslyset når du ikke observerer midlertidig. de
b. Når du observerer med en oljenedsenkingslinse, bruk "ikke-fluorescerende olje". de
c. Fluorescens er nesten alltid svak og bør utføres i et mørkt rom. de
d. Det er best å installere en spenningsstabilisator i strømforsyningen, ellers vil den ustabile spenningen ikke bare redusere levetiden til kvikksølvlampen, men også påvirke effekten av mikroskopinspeksjonen. de
de
4. Bruk av fluorescensmikroskopi
1. Forberedelseskrav for fluorescensmikroskopprøver
en. Glassplate
Tykkelsen på glassplaten skal være mellom 0,8 og 1,2 mm. Et objektglass som er for tykt vil absorbere mer lys på den ene siden, og på den andre siden kan ikke eksitasjonslyset konsentreres på prøven. Objektglassene må være glatte, jevne i tykkelse og fri for tydelig autofluorescens. Noen ganger brukes glassglass av kvarts. de
b. Dekkglass
Tykkelsen på dekkglasset er omtrent 0.17 mm, glatt. For å styrke eksitasjonslyset kan det også brukes et tørt dekkglass, som er et spesielt dekkglass belagt med flere lag av stoffer (som magnesiumfluorid) som har ulik interferenseffekt på lys med ulike bølgelengder, noe som kan gjøre at fluorescens går jevnt. Eksitasjonslys føres gjennom, og det reflekterte eksitasjonslyset eksiterer prøven. de
c. Eksemplar
Vevsskiver eller andre prøver bør ikke være for tykke. Hvis den er for tykk, vil mesteparten av eksitasjonslyset bli forbrukt i den nedre delen av prøven, mens den øvre delen som direkte observeres av objektivlinsen ikke kan eksiteres helt. I tillegg overlapper cellene eller urenheter dekker opp, noe som påvirker dømmekraften. de
d. Monteringsmiddel
Glyserin brukes ofte som monteringsmiddel, som ikke må ha noen autofluorescens, fargeløst og gjennomsiktig, og lysstyrken til fluorescensen er lysere ved pH 8.5-9.5, og det er ikke lett å falme raskt. Derfor brukes en lik blanding av glyserol og 0.5mol/L karbonatbufferløsning med en pH på 9.0 til 9.5 vanligvis som monteringsmiddel. de
e. speil olje
Vanligvis må nedsenkingsolje brukes når du observerer prøver med mørkfelts fluorescensmikroskoper og nedsenkingsmål for olje. Det er best å bruke spesiell ikke-fluorescerende speilolje, som også kan erstattes av den ovennevnte glyserin, og flytende parafin kan også brukes, men brytningsindeksen er lav, noe som påvirker bildekvaliteten litt.
