Metoder for å utvide brenndybden til multifotonmikroskoper
Kombinasjonen av to-fotonlasermikroskop og kalsiumindikator er gullstandarden for in vivo nevronal signaldeteksjon. Nevronene i nevrale nettverk er fordelt i tre-dimensjonalt rom, og å overvåke aktivitetsdynamikken deres krever en måte å raskt forbedre volumavbildningshastigheten på. Ved å bruke et multifotonmikroskop med rist for å avbilde et stort antall bilder, hvis et objektiv med høy numerisk blenderåpning (NA) brukes for å oppnå høyere sideoppløsning, vil det resultere i en mindre brenndybde. For å oppnå volumavbildning ved en liten brenndybde,
Det er nødvendig å utføre Z--akseskanning på noen måte, og avbilde mange plan ved å skanne hvert fokalplan, noe som i stor grad begrenser bildehastigheten. Hvis aksial bildeinformasjon kan ofres og volumskanning kan oppnås i én lateral skanning ved å utvide fokusdybden, det vil si at voluminformasjonen projiseres på et enkelt 2D-bilde, kan bildehastigheten forbedres betraktelig. Dette kalles EDF-avbildning (Extended Depth of Focus), som er spesielt nyttig for å avbilde sparsomme befolkningsstrukturer som krever høy tidsoppløsning, for eksempel funksjonell avbildning av nevronaktivitet.
De aksiale og laterale oppløsningene til et mikroskop bestemmes av den numeriske blenderåpningen (NA) til objektivlinsen. Høy NA kan maksimere aksial og lateral oppløsning så vel som mengden lys som samles inn; Lavere NA vil gi lavere aksial oppløsning, dvs. lengre fokusdybde, men samtidig ofre sideoppløsning og lyssamlingseffektivitet. Metoden for å utvide fokusdybden som vil bli introdusert neste gang, kan oppnå dette samtidig som høy sideoppløsning og tilstrekkelig lysstrøm opprettholdes.
Bruken av romlige lysmodulatorer for å generere fokale slanke Bessel-stråler kan oppnå EDF-avbildning, men romlige lysmodulatorer er store og vanskelige å være kompatible med trange mikroskoprom; Derimot er Bessel-moduler basert på aksiale pyramider billige og kompakte, men de kan bare generere brennpunkter med fast dybde og er ikke egnet for ulike eksperimenter som krever kontinuerlige endringer i brenndybde. For å løse dette problemet, i 2018, RONGWEN LU et al. demonstrerte en Bessel-modul basert på et aksikon, der bare én linse trenger å bli oversatt langs den optiske aksen for kontinuerlig å justere den aksiale lengden til Bessel-fokuspunktet.
Figur 1 (a) Bessel-modulenhetsdiagram; (b) Punktspredningsfunksjonen ble eksperimentelt målt når D var henholdsvis -12 mm, 0 mm og 12 mm; (c) Forholdet mellom lateral full bredde ved halv maksimum, (d) aksial full bredde ved halv maksimum, (e) toppsignal, og (f) optisk kraft bak objektivlinsen med L2-forskyvning D
Modulanordningen for å danne et Bessel-fokuspunkt med variabel lengde er vist i figur 1a. Den innfallende gaussiske strålen er formet til en sirkulær stråle etter å ha passert gjennom et aksikon og linse L1. Den påfølgende sirkulære blenderåpningsmasken kan blokkere strølys forårsaket av aksikondefekter, og dermed forme den aksiale fordelingen av spredningsfunksjonen for to-fotoneksitasjonspunkter. Etterpå projiseres lysstrålen på galvanometeret av linsene L2 og L3, og når deretter det bakre brennplanet til objektivlinsen gjennom linsene L4 og L5.
Disse designene ligner på tradisjonelle pyramidebaserte moduler, med forskjellen at ved å flytte L2 eller L3 langs den optiske aksen, kan den aksiale lengden på Bessel-fokuset justeres kontinuerlig. Figur 1b viser de aksiale punktspredningsfunksjonene for D-verdier på -12 mm, 0 mm og 12 mm, med aksial full bredde på halvparten maksimalt 39? m,24? M og 14? m. Som vist i figur 1c-f, kan det å flytte linsen L2 fra venstre til høyre kontinuerlig endre hele bredden til halvt maksimum i både tverrgående og aksial retning, noe som betyr at fokusdybden kan endres kontinuerlig. De numeriske simuleringsresultatene basert på vektordiffraksjonsteori er i god overensstemmelse med eksperimentelle data. Figur 2 verifiserer korrigeringseffekten av forskjellige størrelser av ringformede masker på aksikondefekter. Det er funnet at tynnere ringformede masker bedre kan optimalisere den aksiale intensitetsfordelingen til den utgående Bessel-strålen, men samtidig fører de til mer effekttap.
