Prinsipper for laserkonfokalmikroskopi (LSCM)
Et konfokalt lasermikroskop bruker et belysningsnålhull plassert bak lyskilden og et deteksjonsnålhull plassert foran detektoren for å oppnå punktbelysning og punktdeteksjon. Lys fra lyskilden fokuseres på et punkt i brennplanet til prøven av lys som sendes ut gjennom belysningsnålhullet, og fluorescens som sendes ut fra det punktet avbildes i deteksjonsnålhullet, og alt utsendt lys utenfor dette punktet blokkeres av deteksjonsnålehull. Belysningsnålhullet og deteksjonsnålhullet er konjugert for det opplyste eller detekterte punktet, slik at det detekterte punktet er konfokalpunktet og planet der det detekterte punktet befinner seg er det konfokale planet. Datamaskinen viser det oppdagede punktet på dataskjermen i form av et bildepunkt. For å produsere et komplett bilde, skanner et skanningssystem i den optiske banen over brennplanet til prøven, og produserer dermed et fullstendig konfokalt bilde. Så lenge bærertrinnet flyttes opp og ned langs Z-aksen, flyttes et nytt nivå av prøven til det konfokale planet, og det nye nivået av prøven avbildes på skjermen, mens Z-aksen fortsetter å bevegelse, oppnås påfølgende lyskuttede bilder av forskjellige nivåer av prøven.
Det tradisjonelle optiske mikroskopet bruker en feltlyskilde, bildet av hvert punkt på prøven vil bli forstyrret av diffraksjon eller spredning av lys fra nabopunktene; laserskannende konfokalmikroskop bruker en laserstråle gjennom det opplyste nålehullet for å danne en punktlyskilde på prøven skannet ved hvert punkt av det indre fokalplanet, prøven på det bestrålte punktet, avbildningen av deteksjonsnålhullet, ved deteksjon av nålehull etter punkt for lys multiplikasjonsrør (PMT) eller kald elektrokoblet enhet (cCCD) Mottatt punkt-for-punkt eller linje-for-linje, dannes det raskt et fluorescerende bilde på dataskjermen. Belysningsnålehull og deteksjonsnålhull i forhold til fokalplanet til objektivlinsen er konjugert, punktet på brennplanet samtidig fokusert på belysningsnålhullet og emisjonsnålhullet, punktet utenfor brennplanet vil ikke være i deteksjonen av pinhole ved avbildningen, slik at det oppnådde konfokale bildet er prøvens optiske tverrsnitt, og overvinner manglene ved det vanlige mikroskopbildet uklart.
Fra det grunnleggende prinsippet er laserkonfokalmikroskop et moderne optisk mikroskop, det er det vanlige lysmikroskopet fra teknologien for å gjøre følgende forbedringer.
1. Bruk laser som lyskilde fordi monokromaticiteten til laseren er veldig god, bølgelengden til lyskildestrålen er den samme, noe som fundamentalt eliminerer den kromatiske aberrasjonen.
2. Bruken av konfokal teknologi i fokalplanet til objektivlinsen plassert i midten med et lite hull i ledeplaten, brennplanet utenfor strølyset blokkerer, og eliminerer den sfæriske aberrasjonen; og ytterligere eliminere den kromatiske aberrasjonen.
3. Konfokalt lasermikroskop som bruker punktskanningsteknologi for å dekomponere prøven til todimensjonale eller tredimensjonale rom til utallige punkter, med en veldig liten laserstråle (punktlyskilde) punkt for punkt, linje for linje skanningsavbildning, og deretter gjennom mikrodatamaskinkombinasjonen av et helt plan eller tredimensjonalt bilde. Det tradisjonelle lysmikroskopet er en feltlyskilde under engangsavbildningen, prøver på hvert punkt av bildet vil være ved siden av punktet med diffraktert lys og spredt lysinterferens. Klarheten og presisjonen til disse to bildene kan ikke sammenlignes.
4. Innsamling og behandling av optiske signaler med en datamaskin og forsterkning av signalene med et fotomultiplikatorrør
I det konfokale lasermikroskopet erstatter datamaskinen det menneskelige øyet eller kameraet for observasjon og videoopptak, og bildene som oppnås digitaliseres og kan behandles i datamaskinen for å forbedre klarheten i bildene igjen. Dessuten kan bruken av fotomultiplikatorrør forsterke svært svake signaler, noe som i stor grad forbedrer følsomheten. Som et resultat av den kombinerte bruken av de ovennevnte teknologiene, kan det sies at LSCM er det mest avanserte mikroskopet i verden. Det kan sies at LSCM er kombinasjonen av mikroskopproduksjonsteknologi, fotoelektrisk teknologi, datateknologi **, er det uunngåelige produktet av utviklingen av moderne teknologi.
