Krav til prøveforberedelse for fluorescensmikroskopi
Krav for klargjøring av prøve for fluorescensmikroskopi
(1) Glasssklie
Tykkelsen på lysbildeglasset skal være mellom 0.8-L2 mm. Et lysbilde som er for tykt vil absorbere mer lys på den ene siden og kan ikke fokusere eksitasjonslyset på prøven på den andre siden. Objektglassene må være glatte, jevne i tykkelse og fri for tydelig autofluorescens. Noen ganger brukes kvartsglass.
(2) Dekkglass
Tykkelsen på dekkglasset er omtrent 0.17 mm, glatt. For å styrke eksitasjonslyset kan det også brukes et interferensdekselglass, som er et spesielt dekkglass belagt med flere lag av stoffer (som magnesiumfluorid) som har ulik interferenseffekt på lys med forskjellige bølgelengder, noe som kan gjøre at fluorescens jevn. Eksitasjonslys sendes gjennom, og eksitasjonslyset reflekteres, og dette reflekterte eksitasjonslyset kan opphisse prøven.
(3) Prøve
Vevsskiver eller andre prøver bør ikke være for tykke. Hvis tykkelsen er for tykk, vil det meste av eksitasjonslyset bli forbrukt i den nedre delen av prøven, mens den øvre delen som observeres direkte av objektivlinsen ikke kan eksiteres helt. I tillegg påvirker fluorescens forårsaket av overlappende celler eller urenheter, ikke-spesifikk bakgrunnsfarging vurderingen.
(4) speilolje
Vanligvis, når du observerer prøver med mørkfelts fluorescensmikroskoper og oljeneddykkingsmikroskoper, må det brukes immersionsolje. Det er best å bruke spesiell ikke-fluorescerende nedsenkingsolje. Glyserin kan også brukes i stedet, og flytende parafin kan også brukes, men brytningsindeksen er lav, noe som har en liten innvirkning på bildekvaliteten.
Forstå lyskuben til fluorescensmikroskopi
Fluorescens er lyset som elektroner i et stoff absorberer lysenergi fra en lavenergitilstand til en høyenergitilstand, og deretter frigjør lys når det går tilbake til en lavenergitilstand. Det er ikke-temperaturutstrålt lys—luminescens. Det vil si: stoffet absorberer kortbølget lys, går inn i en eksitert tilstand og sender ut langbølget lys.
Enten det er autofluorescensen til stoffet, det fluorescerende fargestoffet eller det fluorescerende proteinet uttrykt ved fusjon, må det eksiteres av en spesifikk bølgelengde av lys (eksitasjon). Etter at elektronene migrerer og mister energi, sender de ut lys med en bestemt lang bølgelengde (Emision). , som kan samles inn av deteksjonssystemet for å oppnå funksjonen med å identifisere spesifikk fluorescens.
Hva er en fluorescerende lyskube?
Ved fluorescensmikroskopobservasjon og -avbildning blir eksitasjonslyset med spesifikk bølgelengde og det tilsvarende emisjonslyset med lang bølgelengde levert av fluorescenslyskuben, slik at fluorescenssignalet kan samles opp med det blotte øye, skjerm eller kamera. Derfor bestemmer fluorescenslyskuben hva som kan oppdages. Nøkkelenheten til fluorescenssignalet, dens egenskaper inkluderer EX: eksitasjonsbølgelengdefilterparametere, EM: emisjonsbølgelengdefilterparametre og DM: dikotome speilparametere. Ta DAPI-lyskuben til Revolve integrerte fluorescensmikroskop som et eksempel, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425nm lys kan overføres til EM; EM-emisjonsfiltre brukes til å skille fluorescensen som sendes ut av fluoroforen fra andre optiske bakgrunnselementer for å separere lys. Emisjonsfiltre sender lys ved fluorescensbølgelengden gjennom det dikroiske speilet mens de blokkerer alt annet lys som lekker fra eksitasjonslyskilden (reflektert fra prøven eller optikken). Den utsendte lysbølgelengden er større enn EM som skal observeres, det vil si at bare lys innenfor området 450±25nm kommer inn i deteksjonssystemet. Riktig valg av EX-, EM-filtre og DM-dikotomier kan hjelpe forskere med å oppnå høyere signal-til-støy-forhold (S/N).
