Anvendelse av fluorescens total intern refleksjon fluorescensmikroskopi
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), total intern refleksjonsfluorescensmikroskop, når lys kommer inn i et medium med lavere brytningsindeks fra et medium med høy brytningsindeks, hvis innfallsvinkelen er stor nok, reflekteres alt lyset uten brytning, men i Grensesnittet mellom de to media produserer flyktige bølger som kan eksitere fluorescensen innenfor 100nm nær grensesnittet for å realisere observasjonen av objektoverflaten. Eksitasjonslyset kan sendes gjennom illuminatoren til et konvensjonelt fluorescensmikroskop eller en spesiell illuminator, og innfallsvinkelen til laseren kan kontrolleres. Den øyeblikkelige felteksitasjonsmetoden brukes for å forhindre at eksitasjonslyset kommer inn i detektoren. Eksitasjonslyset i grensesnittet mellom glass og vann produserer en full intern implementert ved refleksjon. På grunn av eksponentiell dempning av eksitasjonslyset, vil bare prøveområdet svært nær den totale refleksjonsoverflaten produsere fluorescensrefleksjon, noe som i stor grad reduserer interferensen av bakgrunnslysstøy til observasjonsmålet, så denne teknologien er mye brukt i den dynamiske observasjonen. av celleoverflatestoffer.
Skjematisk diagram av total intern refleksjon fluorescensmikroskopi (TIRFM)
①Eksempel ②Evanescent bølgeområde ③Dekkglass ④Oljenedsenking ⑤Mål ⑥Emisjonsstråle (signal) ⑦Eksitasjonsstråle
For å oppnå total intern refleksjon kreves det en stor innfallsvinkel, for eksempel er innfallsvinkelen ved glass-vann-grensesnittet større enn 61 grader. Dette kan oppnås med et prisme, kalt prismebasert TIRFM, eller ved et objektiv med høy numerisk blenderåpning, som kalles objektivtype TIRFM. De nåværende kommersialiserte totalrefleksjonsfluorescensmikroskopene er generelt av objektivlinsetypen, med høy hastighet og høy presisjon.
Total intern refleksjon fluorescensmikroskopi er mye brukt i noen biologiske felt fordi den kan realisere fluorescensobservasjon i et veldig tynt område (mindre enn 100nm) på overflaten av objekter. For eksempel følgende applikasjoner:
Observasjon av celleoverflatebilder: cellemembranoverflatestruktur, celleoverflatekontakt, membranoverflatedynamikk/proteinlokalisering.
Enkeltmolekylobservasjon og manipulasjon: myosin, aktin og Cy3-merket ATP.
Cellemembranoverflatebevegelse: slik som vesikkeloppsluging, vesikkelutånding og eksokrin vesikkel. de
Observasjon av kalsiumgnistfenomen i cellemembran, ionekanalovervåking.
Molekylær motorisk forskning: rotasjonsmotorer, cytoskjelettproteiner, polymerer, G-proteiner, ringproteiner, nukleotidmotorer.
I tillegg til feltet biologi, har det også gode anvendelser innen kjemi for observasjon av kjemiske molekylære strukturer.
