Hvordan fluorescensmikroskopi skiller seg fra konvensjonell mikroskopi
Jeg prøvde nylig å lage noen frosne seksjoner av mus, og nå må jeg bruke et fluorescensmikroskop for å se om viruset jeg injiserte er i ønsket hjerneområde. Noen grunnleggende prinsipper for fluorescensmikroskopi må studeres kort, og jeg vil også dele dem her.
Fluorescensmikroskop bruker ultrafiolett lys som lyskilde for å belyse objektet som testes, noe som får objektet til å avgi en lyskilde, og deretter observere objektet under mikroskopet. Hovedsakelig brukt for immunofluorescensceller, den er sammensatt av en lyskilde, filterplatesystem og optisk system for å observere fluorescensbildet av prøven gjennom forstørrelse av okularet og objektivlinsen. La oss ta en titt på forskjellen mellom dette fluorescensmikroskopet og et vanlig optisk mikroskop.
1. Når det gjelder belysningsmetoder
Lysmetoden til et fluorescensmikroskop bruker vanligvis en fallstrålemetode, som betyr at lyskilden projiseres på testprøven gjennom objektivlinsen.
2. Når det gjelder oppløsning
Fluorescensmikroskopi bruker ultrafiolett lys som lyskilde, med relativt kort bølgelengde men høyere oppløsning enn vanlige optiske mikroskoper.
3. Forskjeller på filteret
Et fluorescensmikroskop bruker to spesielle filtre, ett foran lyskilden for å filtrere ut synlig lys, og det andre mellom objektivet og okularet for å filtrere ut ultrafiolett lys, som kan beskytte øynene.
Fluorescensmikroskopi er også en type optisk mikroskop, hovedsakelig fordi bølgelengden eksitert av fluorescensmikroskopi er kort, noe som fører til forskjeller i struktur og bruk av fluorescensmikroskopi og vanlig mikroskopi. De fleste fluorescensmikroskoper har en god funksjon for å fange svakt lys, så deres avbildningsevne er også god under ekstremt svak fluorescens. I tillegg, med den kontinuerlige forbedringen av fluorescensmikroskopi de siste årene, har også støyen blitt betydelig redusert. Derfor brukes flere og flere fluorescensmikroskoper.
Kunnskap knyttet til to-foton fluorescensmikroskopi
Grunnprinsippet for to-foton-eksitasjon er at ved høy fotontetthet kan fluorescerende molekyler samtidig absorbere to lange bølgelengdefotoner, og etter en kort periode med såkalt eksitert tilstandslevetid, sende ut et kortere bølgelengdefoton; Effekten er den samme som å bruke et foton med en bølgelengde på halvparten av den lange bølgelengden for å eksitere fluorescerende molekyler. Eksitering av to foton krever høy fotontetthet, og for å unngå å skade celler, brukes en høyenergimoduslåst pulslaser i et tofotonmikroskop. Laseren som sendes ut av denne typen laser har høy toppenergi og lav gjennomsnittsenergi, med en pulsbredde på kun 100 femtosekunder og en frekvens på opptil 80 til 100 megahertz. Når du bruker et objektiv med høy numerisk blenderåpning for å fokusere fotonene til en pulserende laser, er fotontettheten i fokuspunktet til objektivet høyest, og to-foton-eksitasjon skjer kun ved brennpunktet til objektivet. Derfor krever ikke et to-fotonmikroskop konfokale nålehull, noe som forbedrer effektiviteten av fluorescensdeteksjon.
I generelle fluorescensfenomener, på grunn av den lave fotontettheten av eksitasjon, kan et fluorescerende molekyl bare absorbere ett foton samtidig, og deretter sende ut ett fluorescerende foton gjennom strålingsovergang, som kalles enkeltfotonfluorescens. For fluorescenseksitasjonsprosessen ved bruk av laser som lyskilde, kan to-foton eller til og med multifoton fluorescensfenomener forekomme. På dette tidspunktet er eksitasjonslyskilden som brukes av høy intensitet, og fotontettheten oppfyller kravet til fluorescerende molekyler for å absorbere to fotoner samtidig. I prosessen med å bruke en typisk laser som eksitasjonslyskilde, er fotontettheten fortsatt ikke tilstrekkelig til å generere to-foton absorpsjonsfenomen. Vanligvis brukes femtosekund-pulslasere, og deres øyeblikkelige kraft kan nå nivået på megawatt. Derfor er bølgelengden til to-foton-fluorescens kortere enn eksitasjonslengden, noe som tilsvarer effekten produsert av halv eksitasjonsbølgelengde-eksitasjon.
