Forbedringsfordeler med laserskanning multifotonmikroskopi
Laserskannende multifotonmikroskopi representerer et stort fremskritt innen optisk mikroskopi. Den muliggjør observasjon av dype strukturer i levende celler, faste celler og vev, samtidig som den fanger klare og skarpe flerlags Z-planstrukturer - nemlig optiske seksjoner - som kan brukes videre til å rekonstruere den tredimensjonale solide strukturen til prøver.
Et konfokalt mikroskop tar i bruk en laserlyskilde. Laserstrålen utvides for å fullt ut belyse det bakre brennplanet til objektivlinsen, og passerer deretter gjennom objektivlinsesystemet og konvergerer til et ekstremt lite sted på brennplanet til prøven. Avhengig av den numeriske blenderåpningen til objektivlinsen, varierer diameteren til det opplyste punktet omtrent fra 0,25 til 0,8 μm, med en aksial dybde på ca. 0,5 til 1,5 μm. Størrelsen på det konfokale punktet bestemmes av mikroskopets design, laserbølgelengde, objektive egenskaper, innstillinger for skanneenhet og prøveegenskaper.
Vidfeltmikroskoper har et stort belysningsområde og dyp belysningsdybde, mens konfokalmikroskopi konsentrerer belysningen til et presist fokuspunkt på brennplanet. Kjernefordelen med konfokal mikroskopi ligger i dens evne til å utføre fin optisk seksjonering på tykke fluorescerende prøver (opptil 50 μm eller mer), med hver seksjonstykkelse fra 0,5 til 1,5 μm.
En serie med optiske snittbilder tas ved å flytte prøven vertikalt via mikroskopets presisjons Z-akse-trinnmotor. Bildesignalinnsamling er strengt begrenset til det målrettede fokalplanet og fri for interferens fra signaler som stammer fra andre posisjoner i prøven. Etter å ha eliminert bakgrunnsfluorescens og forbedret signal-til-støyforhold, viser konfokale bilder betydelig høyere kontrast og oppløsning sammenlignet med tradisjonelle bredfeltsfluorescensbilder.
I de fleste prøver veves intrikate strukturelle komponenter sammen for å danne komplekse systemer. Når et tilstrekkelig antall optiske seksjoner er samlet inn, kan tredimensjonal rekonstruksjon fullføres ved hjelp av profesjonell programvare. Denne eksperimentelle metoden har blitt mye brukt i biologisk forskning for å klargjøre de komplekse strukturelle og funksjonelle relasjonene mellom celler og vev.
