Kunnskap om Two-Photon Fluorescence Microscopy
Grunnprinsippet for to-fotoneksitasjon er at ved høy fotontetthet kan fluorescerende molekyler samtidig absorbere to fotoner med lang bølgelengde og sende ut et foton med kortere bølgelengde etter en kort periode med-såkalt eksitert tilstandslevetid; Effekten er den samme som å bruke et foton med halve bølgelengden av den lange bølgelengden for å eksitere fluorescerende molekyler. Eksitering av to fotoner krever høy fotontetthet, og for å unngå å skade celler bruker to-fotonmikroskopi høy-energimodus-låste pulslasere. Laseren som sendes ut av denne laseren har høy toppenergi og lav gjennomsnittsenergi, med en pulsbredde på bare 100 femtosekunder og en frekvens på opptil 80 til 100 megahertz. Når du bruker en objektivlinse med høy numerisk blenderåpning for å fokusere fotonene til en pulserende laser, er fotontettheten ved fokuspunktet til objektivlinsen høyest, og eksitasjon av to{11}}fotoner skjer bare ved brennpunktet til objektivlinsen. Derfor krever ikke to-fotonmikroskopet et konfokalt nålehull, noe som forbedrer effektiviteten av fluorescensdeteksjon.
Generelt fluorescensfenomener, på grunn av den lave fotontettheten til eksitasjonslyset, kan et fluorescerende molekyl bare absorbere ett foton om gangen og deretter sende ut et annet fluorescerende foton gjennom strålingsovergang, som er kjent som enkeltfotonfluorescens. For fluorescenseksitasjonsprosesser som bruker lasere som lyskilder, kan to-foton- eller til og med multifotonfluorescensfenomener forekomme. I dette tilfellet har eksitasjonslyskilden som brukes høy intensitet og fotontetthet som oppfyller kravet til fluorescerende molekyler for å absorbere to fotoner samtidig. I prosessen med å bruke en generell laser som eksitasjonslyskilde, er fotontettheten fortsatt utilstrekkelig til å produsere to-fotonabsorpsjonsfenomener. Vanligvis brukes femtosekund-pulslasere, med øyeblikkelig kraft som når megawattnivået. Derfor er bølgelengden til to-fotonfluorescens kortere enn for eksitasjonslys, tilsvarende effekten produsert av halv eksitasjonsbølgelengdeeksitasjon.
