Multifotonmikroskopi avbildning: forskjellige teknikker for avbildning av nevroner in vivo
Sammenlignet med det tradisjonelle enkeltfoton-vidfeltsfluorescensmikroskopet, har multifotonmikroskopi (MPM) funksjonene til optisk seksjonering og dyp avbildning. I 2019, Jerome Lecoq et al. diskuterte relatert MPM-teknologi fra tre aspekter: nevronavbildning dypt i hjernen, massiv nevronavbildning og høyhastighets nevronavbildning.
For å koble nevronaktivitet med kompleks atferd, er det vanligvis nødvendig å avbilde nevroner i den dype cortex, noe som krever at MPM har evnen til dyp avbildning. Eksitasjons- og emisjonslys vil bli svært spredt og absorbert av biologisk vev, som er hovedfaktoren som begrenser bildedybden til MPM. Selv om spredningsproblemet kan løses ved å øke laserintensiteten, vil det føre til andre problemer, for eksempel brenning av prøven, defokusering og fluorescerende eksitasjon nær overflaten. Den beste måten å øke dybden på MPM-avbildning er å bruke lengre bølgelengder som eksitasjonslys.
I tillegg, for to-foton (2P) avbildning, er ufokusert og nær overflaten fluorescenseksitasjon de to største dybdebegrensende faktorene, mens for tre-foton (3P) avbildning er disse to problemene sterkt redusert, men tre-foton-avbildning på grunn av fluorescens Absorpsjonstverrsnittet av gruppen er mye mindre enn det for 2P, så det kreves en størrelsesorden høyere pulsenergi for å oppnå samme intensitetsfluorescenssignal som det som eksiteres av 2P. Funksjonell 3P-mikroskopi er mer krevende enn strukturell 3P-mikroskopi, som krever raskere skanning for å prøve neuronal aktivitet i tide; høyere pulsenergi er nødvendig for å samle tilstrekkelige signaler innenfor oppholdstiden til hver piksel.
Kompleks atferd involverer ofte store hjernenettverk med både lokale og langdistanseforbindelser. For å koble nevronaktivitet med atferd, er det nødvendig å overvåke aktiviteten til veldig store og vidt distribuerte nevroner på samme tid. Det nevrale nettverket i hjernen behandler innkommende stimuli i løpet av titalls millisekunder. For å forstå dette raske nevrale nettverket For å studere nevrondynamikk, kreves det at MPM har evnen til raskt å avbilde nevroner. Raske MPM-metoder kan deles inn i enkeltstråleskanningsteknikker og multistråleskanningsteknikker.
Enkeltstråleskanningsteknologi muliggjør høyhastighetsgjennomgang av nevralt vev med et stort synsfelt (FOV)
Når du bruker MPM til å avbilde nevroner, kan skanning med tilfeldig tilgang – det vil si at laserstrålen raskt skannes på et hvilket som helst valgt punkt i hele synsfeltet – kun skanne nevronene av interesse, noe som ikke bare unngår å skanne eventuelle umerkede nervefibre. optimalisere også skannetiden til laserstrålen. Random-access skanning (fig. 1) kan oppnås med en akusto-optisk deflektor (AOD), som fungerer ved å binde en piezoelektrisk transduser med et radiofrekvenssignal til en passende krystall. De resulterende akustiske bølgene induserer et periodisk brytningsindeksgitter. Diffraksjon oppstår når en laserstråle passerer gjennom et gitter. Intensiteten og frekvensen til lydbølgen kan justeres av det elektriske radiofrekvenssignalet for å endre intensiteten og retningen til det diffrakterte lyset, slik at endimensjonal horisontal vilkårlig punktskanning kan realiseres ved å bruke en AOD, og 3D kan realiseres ved å bruke et par AOD-er kombinert med andre aksiale skanningsteknologier tilfeldig tilgangsskanning. Imidlertid er denne teknikken svært følsom for bevegelsen til prøven og utsatt for bevegelsesartefakter. For tiden er rask rasterskanning, det vil si progressiv skanning i FOV, mye brukt fordi algoritmen enkelt kan løse bevegelsesartefaktene.
AOD-basert to-foton avbildning av neokortikale L2/3 nevroner in vivo [2]
Det er mange måter å realisere rask rasterskanning på, ved å bruke et vibrerende speil for rask 2D-skanning, ved å kombinere et vibrerende speil og en justerbar elektrisk linse for rask 3D-skanning, men den justerbare elektriske linsen kan ikke raskt fokusere i aksial retning på grunn av begrensningen av mekanisk treghet Switching, som påvirker bildehastigheten, kan nå erstattes med en romlig lysmodulator (SLM).
Fjernfokusering er også et middel for å oppnå 3D-avbildning, som vist i figur 2. I LSU-modulen skanner galvanometeret horisontalt, og ASU-modulen inkluderer objektivlinsen L1 og speilet M, og den aksiale skanningen realiseres ved å justere posisjonen til M. Denne teknikken kan ikke bare korrigere den optiske aberrasjonen introdusert av hovedobjektivet L2, men også muliggjøre rask aksial skanning. For å oppnå mer nevronavbildning, kan FOV forstørres ved å justere objektivlinsedesignet til mikroskopet, men objektivlinsen med stor NA og stor FOV er vanligvis tung og kan ikke bevege seg raskt for rask aksial skanning, så store FOV-systemer er avhengige av Telefocus , SLM og justerbare motoriserte linser.
Skjematisk diagram av et fjernfokuserende to-foton avbildningssystem[3] Multi-beam skanningsteknologi kan samtidig avbilde forskjellige posisjoner av nevronalt vev
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm fra hverandre) bildebehandlingssteder (fig. 3C,D); for tilstøtende områder bruker den vanligvis flere stråler av en enkelt objektivlinse for avbildning (fig. 3E,F). Flerstråleskanningsteknikken må være spesielt oppmerksom på krysstaleproblemet mellom eksitasjonsstråler, som kan løses ved post-lyskildeseparasjonsmetode eller rom-tid-multiplekseringsmetode. Post-hoc lyskildeseparasjonsmetoden refererer til bruken av algoritmer for å separere strålene for å eliminere krysstale; tid-rom-multipleksingsmetoden refererer til samtidig bruk av flere eksitasjonsstråler, pulsene til hver stråle er forsinket i tid, slik at de individuelle strålene eksitert av forskjellige stråler kan separeres midlertidig. fluorescerende signal. Flere nevroner kan avbildes ved å introdusere flere stråler, men flere stråler vil øke overlappingen av fluorescensnedbrytningstid, noe som begrenser muligheten til å skille signalkilder; og multipleksing har en negativ innvirkning på arbeidshastigheten til elektroniske enheter. Høye krav; et stort antall stråler krever også høyere lasereffekt for å opprettholde et omtrentlig signal-til-støy-forhold for en enkelt stråle, noe som lett kan føre til vevsskade.
Stort område bildebehandlingsteknologi
De siste årene har utviklingen av forskjellige MPM-teknologier utvidet omfanget av vår avbildning av nevralt vev, slik at vi kan avbilde flere nevroner dypt i hjernen med en raskere hastighet, noe som i stor grad har fremmet nevrovitenskapelig forskning og gjort oss i stand til å få en klarere forståelse av hjernens funksjon.
