Prinsipp og strukturelle egenskaper ved fluorescensmikroskoper
Fluorescenslyskilden bruker vanligvis en ultrahøytrykks kvikksølvlampe (50–200 W), som sender ut lys med forskjellige bølgelengder. Imidlertid har hvert fluorescerende stoff en spesifikk eksitasjonsbølgelengde som genererer intens fluorescens. Av denne grunn er det nødvendig med et eksitasjonsfilter (vanligvis tilgjengelig i ultrafiolett, fiolett, blått og grønt) for å la bare eksitasjonslys med en spesifikk bølgelengde passere gjennom og bestråle prøven, samtidig som alle andre bølgelengder absorberes.
Ved bestråling av eksitasjonslys avgir hvert stoff synlig fluorescens med en lengre bølgelengde enn eksitasjonslyset i løpet av ekstremt kort tid. Fluorescens er svært spesifikk og generelt svakere enn eksitasjonslyset. For å observere denne spesifikke fluorescensen, må et barriere- (eller undertrykkingsfilter) installeres bak objektivlinsen. Den har to formål: For det første absorberer og blokkerer den eksitasjonslys fra å komme inn i okularet for å unngå å forstyrre fluorescensobservasjon og skade øynene; for det andre overfører den selektivt spesifikk fluorescens for å produsere en distinkt fluorescerende farge. De to typene filtre må velges og brukes i matchende par.
Fluorescensmikroskoper er delt inn i to typer basert på deres optiske bane:
1. Transmittert lys fluorescensmikroskop
I denne utformingen passerer eksitasjonslyskilden gjennom kondensatoren og prøvematerialet for å eksitere fluorescens. En mørkfeltskondensator brukes ofte, men en standardkondensator kan også brukes; det reflekterende speilet er justert for å omdirigere og sidebestråle eksitasjonslyset på prøven. Dette er en relativt eldre type fluorescensmikroskop. Fordelen er sterk fluorescens ved lav forstørrelse, mens ulempen er at fluorescensintensiteten avtar når forstørrelsen øker. Den er derfor bedre egnet for å observere større prøvematerialer.
2. Epifluorescensmikroskop
Dette er en moderne, nyutviklet type fluorescensmikroskop. I motsetning til utformingen av transmittert lys, projiseres eksitasjonslys nedover gjennom objektivlinsen på prøveoverflaten - den samme objektivlinsen fungerer både som belysningskondensator og fluorescenssamlende objektiv. En dikroisk strålesplitter er installert i den optiske banen i en 45 graders vinkel til den optiske aksen. Eksitasjonslys reflekteres inn i objektivlinsen og fokuseres på prøven. Fluorescensen generert av prøven, sammen med eksitasjonslys reflektert fra overflatene til objektivlinsen og dekkglasset, går samtidig inn i objektivlinsen og går tilbake til den dikroiske strålesplitteren, som skiller eksitasjonslys fra fluorescens. Gjenværende eksitasjonslys absorberes deretter av barrierefilteret.
Ved å bytte filterblokker med ulike kombinasjoner av eksitasjonsfilter, dikroisk strålesplitter og barrierefilter kan kravene til ulike fluorescerende reaksjonsprodukter oppfylles. Fordelene med denne typen fluorescensmikroskop inkluderer jevn feltbelysning, skarp avbildning og økende fluorescensintensitet ved høyere forstørrelser.
