Det er mange fordeler med to-foton fluorescensmikroskopi
1) Lys med lang bølgelengde påvirkes mindre av spredning enn lys med kort bølgelengde og kan lett trenge gjennom prøven;
2) Fluorescerende molekyler utenfor fokalplanet blir ikke eksitert, noe som tillater mer eksitasjonslys å nå fokalplanet, slik at eksitasjonslyset trenger inn i dypere prøver;
3) Nær-infrarødt lys med lang bølgelengde er mindre giftig for celler enn lys med kort bølgelengde;
4) Når du observerer prøver ved hjelp av et to-fotonmikroskop, forekommer fotobleking og fototoksisitet kun på fokalplanet. Derfor er tofotonmikroskoper mer egnet enn enkeltfotonmikroskoper for å observere tykke prøver, for å observere levende celler eller for å utføre fotoblekeeksperimenter med fast punkt.
Kunnskap om konfokal fluorescensmikroskopi
Det grunnleggende prinsippet for konfokal fluorescensmikroskopi: Bruk en punktlyskilde for å belyse prøven for å danne en liten, veldefinert lysflekk på fokalplanet. Fluorescensen som sendes ut av punktet etter å ha blitt belyst, samles opp av objektivlinsen og returneres til det dikroiske speilet langs den opprinnelige belysningslysbanen. utgjøre en stråledeler. Spektrometeret sender fluorescensen direkte til detektoren. Det er et nålhull foran lyskilden og detektoren, som kalles henholdsvis belysningsnålhullet og deteksjonsnålhullet. De geometriske dimensjonene til de to er konsistente, omtrent 100-200nm; i forhold til lyspunktet på fokalplanet, er de to konjugerte, det vil si at lyspunktet passerer gjennom en serie linser og kan til slutt fokuseres på belysningsnålhullet og deteksjonsnålhullet samtidig. På denne måten kan lyset fra fokalplanet konsentreres innenfor deteksjonshullet, mens det spredte lyset fra over eller under fokalplanet blokkeres utenfor deteksjonshullet og ikke kan avbildes. Prøven skannes punkt for punkt med laseren, og fotomultiplikatorrøret bak deteksjonsnålhullet får også det konfokale bildet av det tilsvarende lyset punkt for punkt, som konverteres til et digitalt signal og overføres til datamaskinen, og til slutt aggregeres. på skjermen til et klart konfokalt bilde av hele fokalplanet. .
Hvert fokalplanbilde er faktisk et optisk tverrsnitt av prøven. Dette optiske tverrsnittet har alltid en viss tykkelse og kalles også et optisk tynt snitt. Siden lysintensiteten ved fokuset er mye større enn lysintensiteten ved ikke-fokuset, og lyset i ikke-fokalplanet filtreres av nålehullet, er dybdeskarpheten til det konfokale systemet omtrent null. Skanning langs Z-aksens retning kan realisere optisk tomografi, og danne ønsket. Observer den todimensjonale optiske seksjonen på det fokuserte punktet av prøven. Ved å kombinere XY-plan (fokalplan) skanning med Z-akse (optisk akse) skanning, ved å akkumulere kontinuerlige nivåer av todimensjonale bilder og behandle dem med spesialisert dataprogramvare, kan et tredimensjonalt bilde av prøven oppnås.
Det vil si at deteksjonsnålhullet og lyskildenålhullet alltid er fokusert på samme punkt, slik at fluorescensen eksitert utenfor fokusplanet ikke kan komme inn i deteksjonsnålhullet.
Det enkle uttrykket for arbeidsprinsippet til laserkonfokal er at den bruker laser som lyskilde. På grunnlag av tradisjonell fluorescensmikroskopavbildning legges en laserskanningsenhet og en konjugert fokuseringsenhet til, og systemet styres av en datamaskin for å samle inn og behandle digitale bilder.
