Det er to typer fluorescensmikroskoper når det gjelder deres optiske veier:
1. Transmisjonsfluorescensmikroskop: Eksitasjonslyskilden brukes til å eksitere fluorescens ved å passere gjennom prøvematerialet gjennom en kondensatorlinse. Vanlige mørkefeltkonsentratorer kan også brukes, og vanlige konsentratorer kan brukes til å justere reflektoren for å omdirigere og sidelobe eksitasjonslyset inn på prøven. Dette er et relativt gammelt-fluorescensmikroskop. Fordelen er sterk fluorescens ved lav forstørrelse, men ulempen er at fluorescensen avtar med økende forstørrelse. Derfor er det bedre å observere større prøvematerialer.
2. Fallende lys fluorescensmikroskop er en ny type fluorescensmikroskop utviklet i moderne tid. I motsetning til det ovenfor, faller eksitasjonslyset fra objektivlinsen nedover på overflaten av prøven, ved å bruke den samme objektivlinsen som belysningskondensatoren og objektivlinsen for å samle fluorescens. En stråledeler med to farger må legges til den optiske banen, som er 45 grader fra det lette uranet. Vinkel, eksitasjonslyset reflekteres inn i objektivlinsen og fokuseres på prøven. Fluorescensen generert av prøven, så vel som eksitasjonslyset som reflekteres fra overflaten av objektivlinsen og dekkglasset, går inn i objektivlinsen og går tilbake til tofargestråledeleren, og skiller eksitasjonslyset og fluorescensen. Det gjenværende eksitasjonslyset blir deretter absorbert av blokkeringsfilteret. Hvis det brukes forskjellige kombinasjoner av eksitasjonsfiltre/dobbelte stråleseparatorer/blokkeringsfiltre, kan de dekke behovene til forskjellige fluorescerende reaksjonsprodukter. Fordelene med dette fluorescensmikroskopet er jevn feltbelysning, klar bildebehandling og sterkere fluorescens med større forstørrelse.
