Lavpris fluorescens og lysfeltmikroskopdesign
I denne veiledningen vil jeg gjennomgå de grunnleggende prinsippene for fluorescensmikroskopi og hvordan man konstruerer tre forskjellige rimelige fluorescensmikroskoper. Disse systemene koster vanligvis tusenvis av dollar, men nyere innsats har gjort dem lettere å få tak i. Designet jeg introduserer her bruker smarttelefoner, dSLR og USB-mikroskoper. Alle disse designene kan også brukes som åpne feltmikroskoper.
Trinn 1: Oversikt over fluorescensmikroskopi
For å forstå de grunnleggende konseptene for fluorescensmikroskopi, se for deg de tette skogene, trærne, dyrene, buskene og andre skogene som lever i skogen om natten. Hvis du lyser med lommelykt inn i skogen, vil du se alle disse strukturene og det er vanskelig å forestille seg bestemte dyr eller planter. Forutsatt at du kun er interessert i å se blåbærbusker i skogen. For å få til dette må du trene ildfluer til å kun bli tiltrukket av blåbærbusker, slik at når du ser på skogen er det kun blåbærbusker som lyser opp. Du kan si at du merket blåbærbuskene med ildfluer, slik at du kan se blåbærstrukturene i skogen.
I denne analogien representerer skogen hele prøven, blåbærbusken representerer strukturen du ønsker å visualisere (som spesifikke celler eller subcellulære organeller), og ildfluer er fluorescerende forbindelser. Situasjonen med å skyte en lommelykt alene uten ildfluer ligner på et lysfeltmikroskop.
Det neste trinnet er å forstå de grunnleggende funksjonene til fluorescerende forbindelser (også kjent som fluoroforer). Fluorescerende klynger er faktisk små objekter (nanoskala) designet for å koble sammen spesifikke strukturer i prøven. De absorberer lys med et smalt bølgelengdeområde og sender ut lys med en annen bølgelengde på nytt. For eksempel kan en fluorescerende gruppe absorbere blått lys (dvs. den fluorescerende gruppen eksiteres av blått lys) og deretter sende ut grønt lys igjen. Vanligvis oppsummeres dette gjennom eksitasjons- og emisjonsspektra (som vist i figuren over). Disse diagrammene viser bølgelengdene til lyset absorbert av fluoroforen og bølgelengdene til lyset som sendes ut av fluoroforen.
Utformingen av mikroskopet ligner veldig på et vanlig åpent feltmikroskop, med to hovedforskjeller. For det første må lyset som lyser opp prøven være på bølgelengden til den eksiterte fluorescerende gruppen (for eksempelet ovenfor er lyset blått). For det andre trenger mikroskopet kun å samle opp lys (grønt lys) mens det blokkerer blått lys. Dette er fordi blått lys er overalt, men grønt lys kommer kun fra bestemte strukturer i prøven. For å blokkere blått lys har mikroskoper vanligvis noe som kalles et langpassfilter som lar grønt lys passere uten blått lys. Hvert langpassfilter har en cutoff-bølgelengde. Hvis bølgelengden til lys er større enn cutoff-bølgelengden, kan det passere gjennom et filter. Derfor er navnet "Long Distance Pass". Kortere bølgelengder er blokkert.
Trinn 2: Modellering av et mikroskop ved hjelp av optisk optikk
Dette er et ekstra trinn i utformingen av det grunnleggende prinsippet for et mikroskop. Det er ikke nødvendig å bygge et fluorescensmikroskop, så hvis du ikke vil fordype deg i optikk, kan du hoppe over det.
Både lysfelt- og fluorescensmikroskoper kan modelleres ved bruk av stråleoptiske enheter. Den grunnleggende forutsetningen for stråleoptikk er at oppførselen til lys er lik oppførselen til lys som forplanter seg bort fra en lyskilde. Når du ser deg rundt i rommet, vil du se sollyset utenfor vinduet eller lyset som lyspæren bringer. Da blir lyset absorbert eller reflektert av gjenstander i rommet. Noe reflektert lys vil få det til å møte øynene dine. Hvis et objekt er opplyst, kan du forestille deg at hvert punkt på objektet sender ut lys i alle retninger (som vist i bildet ovenfor). Linsen, som linsen i øynene våre, fokuserer lyset til et punkt slik at vi kan se objektet. Uten linse fortsetter lyset å forplante seg utover og danner ikke et bilde.
