Forskjellen mellom (to-foton, konfokalt) fluorescensmikroskop og vanlig mikroskop
Det grunnleggende prinsippet for to-foton-eksitasjon er at ved høy fotontetthet kan lysstoffmolekyler samtidig absorbere to lange bølgelengdefotoner og avgi et kortere bølgelengdefoton etter en kort periode med såkalt ekstern levetid; Effekten er den samme som å bruke et foton med halvparten av bølgelengden til den lange bølgelengden for å begeistre lysstoffmolekyler. To fotoneksitasjon krever en høy fotontetthet, og for å unngå skadelige celler bruker to-foton mikroskopi høyenergimodus-låsede pulslasere. Laseren som sendes ut av denne laseren har høy toppenergi og lav gjennomsnittlig energi, med en pulsbredde på bare 100 femtosekunder og en frekvens på opptil 80 til 100 megahertz. Når du bruker en høy numerisk blenderåpning objektiv for å fokusere fotonene til en pulserende laser, er fotontetettheten ved midtpunktet for objektivlinsen den høyeste, og to-foton-eksitasjon skjer bare ved brennpunktet til objektivlinsen. Derfor krever ikke to-foton-mikroskopet et konfokalt pinhole, noe som forbedrer effektiviteten av fluorescensdeteksjon.
Generelt fluorescensfenomener, på grunn av den lave fotontettheten av eksitasjonslyset, kan et fluorescerende molekyl bare absorbere ett foton om gangen og deretter avgi et annet fluorescerende foton gjennom strålingsovergang, som er kjent som enkeltfotonfluorescens. For fluorescenseksitasjonsprosesser som bruker lasere som lyskilder, kan to-foton eller til og med multifoton fluorescensfenomener oppstå. I dette tilfellet har eksitasjonslyskilden som brukes høy intensitet og fotontetthet som oppfyller kravet til fluorescerende molekyler for å absorbere to fotoner samtidig. I prosessen med å bruke en generell laser som eksitasjonslyskilde, er fotontettheten fremdeles utilstrekkelig til å produsere to-fotonabsorpsjonsfenomen. Vanligvis brukes femtosecond pulslasere, med øyeblikkelig kraft når megawattnivået. Derfor er bølgelengden til to-foton fluorescens kortere enn for eksitasjonslys, tilsvarer effekten produsert av halv eksitasjonsbølgelengde eksitasjon.
Kunnskap relatert til konfokal fluorescensmikroskopi
Det grunnleggende prinsippet for konfokal fluorescensmikroskopi er å bruke en punktlyskilde for å bestrålet prøven, og danne et veldefinert lite lys på fokalplanet. Fluorescensen som sendes ut fra dette stedet etter bestråling er samlet inn av objektivlinsen og sendt tilbake langs den opprinnelige bestrålingsbanen til strålesplitteren sammensatt av et dikroisk speil. Spektrometeret sender fluorescens direkte til detektoren. Det er et pinhole foran både lyskilden og detektoren, kalt henholdsvis belysnings -pinhole og deteksjons pinhole. De geometriske dimensjonene til de to er konsistente, omtrent 100-200 nm; Sammenlignet med lysplassen på fokalplanet, er de to konjugert, noe som betyr at lyset passerer gjennom en serie linser og til slutt kan fokusere på både belysnings -pinhole og deteksjons -pinhole samtidig. På denne måten kan lys fra fokalplanet konvergere innenfor området for deteksjonshullet, mens spredt lys ovenfra eller under fokalplanet er blokkert utenfor deteksjonshullet og kan ikke avbildes. Skanning av prøvepunktet etter punkt med en laser, oppnår fotomultiplikatorrøret etter å ha oppdaget pinhole også det tilsvarende konfokale bildet av lyset punkt for punkt, konverterer det til et digitalt signal og overfører det til datamaskinen, og til slutt aggregerer det til et klart konfokalt bilde av hele fokusplanet på skjermen.
