Det er to typer fluorescensmikroskoper når det gjelder deres optiske vei
1. Transmisjonsfluorescensmikroskop: Eksitasjonslyskilden føres gjennom prøvematerialet gjennom en kondensatorlinse for å eksitere fluorescens. En mørk feltsamler er ofte brukt, og en vanlig solfanger kan også brukes til å justere speilet slik at eksitasjonslyset omdirigeres og omgås til prøven. Dette er et eldre fluorescerende mikroskop. Fordelen er at fluorescensen er sterk ved lav forstørrelse, men ulempen er at fluorescensen avtar med økningen av forstørrelsen. Derfor er det bedre å observere større prøvematerialer.
2. Epi-fluorescensmikroskop er en ny type fluorescensmikroskop utviklet i moderne tid. Forskjellen er at eksitasjonslyset faller fra objektivlinsen ned til overflaten av prøven, det vil si at den samme objektivlinsen brukes som belysningskondensatoren og objektivlinsen for å samle fluorescens. En dikroisk stråledeler må legges til i lysbanen, som er 45 grader unna det lette uranet. Eksitasjonslyset reflekteres inn i objektivlinsen og samles på prøven. Fluorescensen generert av prøven og eksitasjonslyset som reflekteres av linseoverflaten til objektivlinsen og dekkglassoverflaten går inn i objektivlinsen samtidig, og går tilbake til tofargestråledeleren for å gjøre eksitasjonslyset atskilt fra fluorescens , gjenværende eksitasjonslys absorberes av blokkerende filtre. For eksempel å bytte til en kombinasjon av forskjellige eksitasjonsfilter/tofarget stråledeler/blokkeringsfilter, kan det møte behovene til forskjellige fluorescerende reaksjonsprodukter. Fordelen med denne typen fluorescensmikroskop er at belysningen av synsfeltet er jevn, avbildningen er klar, og jo større forstørrelsen er, desto sterkere er fluorescensen.
