Standard prosedyre for kalibrering av polarisatorer i et polariserende mikroskop
Fluorescensmikroskop er forskjellig fra vanlig optisk mikroskop ved at det ikke observerer prøver under belysning av vanlige lyskilder. I stedet bruker den en viss bølgelengde av lys (vanligvis ultrafiolett lys, blåfiolett lys) for å eksitere de fluorescerende stoffene inne i prøven under mikroskopet, noe som får dem til å avgi fluorescens. Derfor er ikke lyskildens rolle i fluorescensmikroskop direkte belysning, men som en energikilde for å eksitere de fluorescerende stoffene inne i prøven. Grunnen til at vi kan observere prøver er ikke på grunn av belysningen av lyskilden, men fluorescensfenomenet som vises av de fluorescerende stoffene inne i prøven etter å ha absorbert den eksiterte lysenergien. Av dette kan man se at karakteristikken ved fluorescensmikroskopi hovedsakelig er at dens lyskilde kan levere en stor mengde eksitasjonslys i et spesifikt bølgelengdeområde, slik at de fluorescerende stoffene i prøven kan oppnå den nødvendige intensiteten av eksitasjonslys. Samtidig skal fluorescensmikroskoper ha tilsvarende filtersystemer. Fluorescensmikroskop er et grunnleggende verktøy i fluorescensvevskjemi. Den er sammensatt av hovedkomponenter som en ultra-høyspent lyskilde, et filtersystem (inkludert eksitasjons- og undertrykkingsfilterplater), et optisk system og et fotografisystem. Den bruker lys med en viss bølgelengde for å begeistre prøven og avgi fluorescens.
1. Metoder for fluorescenseksitasjon: I henhold til lysets bølgelengdeområde er det to typer: UV-eksitasjonsmetode (ved hjelp av ultrafiolett belysning) og BV-eksitasjonsmetode (bruker blåfiolett lys). UV-eksitasjonsmetoden bruker nær ultrafiolett lys kortere enn 400nm for eksitasjon. Denne metoden har ikke synlig eksitasjonslys, så den observerte fluorescensen viser den iboende fluorescensen til fargestoffet, noe som gjør det enkelt å skille den spesifikke fluorescensen på prøven fra selvfluorescensen til bakgrunnsvevet.
2. BV eksitasjonsmetode: Den involverer eksitasjon fra ultrafiolett til blått lys sentrert ved 404nm og 434nm. Denne metoden bruker blått lys for å bestråle prøven, så avskjæringsfilteret til fluorescensobservasjonssystemet må bruke et filter som fullstendig kan blokkere blått lys og fullstendig passere gjennom den nødvendige grønne og gule fluorescensen. Fluorescerende pigmenter brukt til fluorescerende antistoffmetode. Den maksimale absorpsjonsbølgelengden til eksitasjonslys og den maksimale emisjonsbølgelengden for fluorescens er relativt nær, så filteret som brukes i BV-eksitasjonsmetoden må bruke et skarpt kuttet filter. Denne metoden kan bruke blått lys som eksitasjonslys, slik at absorpsjonseffektiviteten til fluorescerende pigmenter er høy, og lysere bilder kan oppnås. Ulempen er at fluorescens under 500nm ikke kan sees, mens fluorescens over 500nm gjør at hele bildet ser gult ut. I den fluorescerende antistoffmetoden bestemmes spesifisiteten for det meste av fargen som er unik for fluorescerende pigmenter, så når man diskuterer subtil spesifisitet, har ulempene ved BV-eksitasjonsmetoden nevnt ovenfor ofte en betydelig innvirkning.
